Юридический Харьков плюс - прийняття від 29.12.1992 N v0204282-92 41c638f88aeb9fd7db1c533b2ba17f10-1

1. Завідуючому відділом охорони здоров'я Ради Міністрів Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних та Севастопольської міської державної адміністрації, голові Департаменту охорони здоров'я та соціального захисту Київської міської державної адміністрації ввести в дію з 01.02.1993 р. "Положення про централізовану серологічну лабораторію, розрахункові норми часу на лабораторні дослідження для діагностики сифілісу, Інструкцію з постановки лабораторних досліджень на сифіліс".

2. Накази Міністра охорони здоров'я СРСР від 27 лютого 1963 р. N 86 та від 2 вересня 1985 р. N 1161 вважати такими, що втратили чинність на території України.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра охорони здоров'я України Мальцева В.І.

ПОЛОЖЕННЯ ПРО ЦЕНТРАЛІЗОВАНУ СЕРОЛОГІЧНУ ЛАБОРАТОРІЮ

1. Загальні положення

Централізовану серологічну лабораторію організовують тільки у складі шкірно-венерологічного диспансеру (республіканського, обласного, міського, в м. Києві, м. Харкові та ін.) на правах відділення.

Централізовану серологічну лабораторію організовують за наказом органу охорони здоров'я, якому підпорядковується шкірно-венерологічний диспансер.

Централізована серологічна лабораторія обслуговує лікувально-профілактичні установи, які прикріплені до неї для проведення серологічних досліджень на венеричні захворювання.

При постановці серологічних реакцій на венеричні захворювання лабораторія керується відповідними методичними вказівками і інструкціями, затвердженими Міністерством охорони здоров'я України.

Керівництво централізованою серологічною лабораторією здійснює завідуючий, призначений головним лікарем шкірно-венерологічного диспансеру.

2. Завдання централізованої серологічної лабораторії.

2.1. Проведення серологічних досліджень крові та ліквору на сифіліс: реакція зв'язування комплементу (РЗК) - Васермана з кардіоліпіновим і трепонемним антигенами плюс реакція мікропреципітації з кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою, реакція іммобілізації блідих трепонем (тест Нельсона), реакція імунофлуоресценції (РІФ), реакція імунофлуоресценції з абсорбцією (РІФ - АБС, імуноферментний аналіз (ІФА), реакція мікропреципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою або інактивованою сироваткою ізольовано та ін.

2.2. Систематичний контроль за якістю серологічних реакцій на венеричні хвороби в процесі досліджень, що проводять в лабораторіях шкірно-венерологічних диспансерів та інших лікувально-профілактичних закладів, які перебувають в районі діяльності шкірно-венерологічного диспансеру, до складу якого входить Централізована серологічна лабораторія.

2.3. Підготовка та підвищення кваліфікації лабораторних працівників з серологічної діагностики сифілісу.

2.4. Надання методичної та консультативної допомоги медичним працівникам лікувально-профілактичних закладів у здобутті, збереженні, пересиланні матеріалу для дослідження та проведення досліджень.

2.5. Участь у науковій розробці питань з серології.

2.6. Проведення облікової та звітної документації і представлення її керівникові шкірно-венерологічного диспансеру, до складу якого входить серологічна лабораторія.

3. Контингенти, що підлягають обов'язковому відбірковому обстеженню на сифіліс:

3.1. Методами реакції зв'язування комплементу (РЗК) і (або) імуноферментного аналізу (ІФА):

- донори крові, кісткового мозку, внутрішніх органів, шкіри, сперми;

- вагітні за час вагітності у першу та другу половину вагітності, крім ІФА, підлягають обов'язковому обстеженню в РЗК;

- особи, що направляються для штучного переривання вагітності;

- хворі гінекологічних, урологічних, неврологічних, проктологічних, психіатричних, онкологічних стаціонарів.

3.2. Контингенти, що підлягають обстеженню на мікрореакцію преципітації з кардіоліпіновим антигеном (МР) і (або) ІФА:

- хворі, що одержаують стаціонарну медичну допомогу, за винятком контингенту, передбаченого п. 3.1;

- всі хворі, що вперше звернулись по амбулаторну допомогу в поточному році;

- особи, що доставлені органами МВС.

3.3. Особи, котрі підлягають періодичним медичним оглядам на венеричні захворювання (декретовані контингенти) метод обстеження на сифіліс встановлює територіальний орган охорони здоров'я (РЗК, мікрореакція преципітації), відповідним наказом в залежності від епідеміологічного стану.

4. Штати, обладнання, постачання.

В кожній централізованій серологічній лабораторії вводять посаду завідуючого лабораторією. Посади лікарів-лаборантів та середніх лаборантів встановлюють у відповідності з "Розрахунковими нормами часу на імунологічні дослідження для діагностики сифілісу", затвердженими Міністерством охорони здоров'я України (додаток 2 до наказу МОЗ України від 29.12.92 р. N 204).

Централізована серологічна лабораторія може мати віварій для утримання тварин, які необхідні для забезпечення нормальної роботи лабораторії.

ВИКОРИСТАННЯ РОЗРАХУНКОВИХ НОРМ ЧАСУ НА ДОСЛІДЖЕННЯ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

РОЗРАХУНКОВІ НОРМИ ЧАСУ ВИКОРИСТОВУЮТЬ ДЛЯ:

- вирішення питань удосконалення організації діяльності серологічних лабораторій;

- планування та організації праці лікарів-лаборантів і лаборантів;

- аналізу працевитрат персоналу лабораторії;

- формування штату лабораторій;

- визначення розцінок дослідження під час переходу бюджетних закладів охорони здоров'я на нові умови господарювання.

Розрахункові норми часу розроблено в основному для ручних уніфікованих методів дослідження.

При використанні засобів механізації та автоматизації час аналізу скорочується, а норми можуть бути змінені на основі хронометражних вимірів.

РОЗРАХУНКОВІ НОРМИ ЧАСУ ВКЛЮЧАЮТЬ:

- витрати часу лікарів-лаборантів на розрахунок необхідної кількості інгредієнтів та їх розведення, приготування реактивів, титрацію комплементу, постановку контролю інгредієнтів у кожному досліді, безпосереднє проведення досліджень, облік результатів і запис їх у робочі журнали, бланки аналізів та картотеку;

- витрати часу лаборантів з середньою освітою на безпосереднє проведення певних етапів досліджень і трудових операцій, приготування реактивів і дезрочинів, запис результатів у робочі журнали.

Питома вага роботи медперсоналу для безпосереднього проведення досліджень (основна і допоміжна діяльність) становить у лікарів-лаборантів і середніх лаборантів 90 % робочого часу.

Цей час і включено до розрахункових норм. Решту робочого часу використають: лікарі-лаборанти - на освоєння нових методів та апаратури, проведення досліджень з контролю якості, попереднє приготування реактивів, навчання і контроль за роботою персоналу, участь у конференціях та нарадах, короткочасний передпочинок під час роботи з мікроскопом і іншими оптичними приладами, для передавання необхідної інформації в лікпрофустанови, виходів (виїздів) для перевірки якості постановки досліджень на сифіліс та наданню організаційно-методичної допомоги; лаборанти - на всю підготовчу роботу на початку робочого дня, видання результатів аналізів, догляд за апаратурою, стерилізацію інструментарію і лабораторного посуду, попереднього приготування реактивів, приведення робочого місця в порядок в кінці робочого дня.

Час переходів (переїздів) для взяття лаборантом матеріалу для дослідження враховують по фактичним затратам.

У розрахункових нормах вказано виконавця роботи - лікаря-лаборанта або лаборанта, в залежності від розподілу роботи, яка пропонується в розрахункових нормах.

Перелік функціональних обов'язків визначено в посадових інструкціях.

Оптимальне співвідношення посад фельдшерів-лаборантів і лаборантів установлюють у кожній установі на розсуд адміністрації.

Для завідуючих лабораторіями, в штаті яких 5-10 посад лікарів-лаборантів, обсяг роботи становить 50 %. При наявності більше 10 посад лікарів-лаборантів завідуючий лабораторією звільняється від безпосереднього проведення досліджень.

Загальнорічний бюджет робочого часу посади лікаря-лаборанта або лаборанта при 282 робочих днях (з 365 вираховують 59 вихідних і святкових, 24 дні відпустки і по 0,5 години перед вихідними днями при 6,5 годинному робочому дні) становить:

при 6-годинному робочому дні 101520 хвилин (282 х 6,0 х 60 хвилин), при 6,5-год. робочому дні медреєстратора - 108210 хвилин (282 х 6,5 х 60 хвилин - 59 х 30 хвилин).

Річний бюджет робочого часу (РБ) на проведення досліджень становить у лікаря-лаборанта і лаборанта 91368 хв. (90 % від загальнорічного бюджету робочого часу), у медреєстратора - 97389 хв. (90 % від загальнорічного бюджету робочого часу).

Для розрахунку числа посад лікарів-лаборантів або лаборантів необхідно визначити річний обсяг діяльності посади (РО) у хвилинах на основі розрахункових норм часу і даних про кількість досліджень і трудових операцій, проведених за рік.

Попередньо необхідно визначити час, витрачений лікарем-лаборантом на постановку кожного виду досліджень за рік (час у хвилинах на 1 дослідження помножити на кількість даного виду досліджень), а також час, витрачений лікарем-лаборантом або лаборантом на проведення кожної трудової операції за рік (час у хвилинах на трудову операцію з 1-м зразком крові помножити на кількість даних трудових операцій).

Сума одержаних результатів - це річний обсяг діяльності (РО) даної посади у хвилинах.

де РО - річний обсяг роботи посади в хвилинах,

РБ - річний бюджет робочого часу посади у хв.

За рік лікар-лаборант проводить:

МР з інактивованою сироваткою, якісна методика -

При цьому проведено трудові операції - оформлення результатів на бланку і внесення результатів на бланку і внесення результатів у картотеку - 40000+2000+1000=43000.

Річний обсяг діяльності (РО) даного лікаря - 136250 хвилин (0.75 хв х 40000 + 0.75 хв х 40000 + 6 хв х 500 + 0,75 хв х 40000 + 0,75 хв х 2000 + 0,75 хв х 1000 + 1 хв х 43000).

Річний бюджет (РБ) робочого часу посади лікаря-лаборанта - 91368 хв. Необхідне число посад (П) лікарів-лаборантів - 1,5 (138250 хв : 91368 хв = 1,51).

Посади санітарок установлюють з розрахунку 0.5 посади санітарки на кожну 1-у посаду лікаря-лаборанта.

ІНСТРУКЦІЯ ПРО ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ СЕРОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЬ НА СИФІЛІС

Ця Інструкція передбачає застосування таких досліджень:

1. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з кардіоліпіновим антигеном, якісна методика (у тому числі РЗК на холоді).

2. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемним антигеном, якісна методика (у тому числі РЗК на холоді).

3. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з кардіоліпіновим антигеном, кількісна методика.

4. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з інактивованною сироваткою, якісна методика.

Примітка: Під час дослідження сироватки на сифіліс всі вказані вище реакції ставляться одночасно і обов'язково (п.1-4).

5. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою крові, якісна методика.

6. Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з плазмою або інактивованою сироваткою крові, кількісна методика.

7. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з спинномозковою рідиною з кардіоліпіновим антигеном (у дозах 0,5-0,25-0.1).

8. Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемним антигеном (у дозах 0,5-0,25-0,1).

Примітка: Під час дослідження спинномозкової рідини реакції, зазначені в п. 7 і 8, ставляться одночасно і обов'язково.

9. Реакція імунофлуоресценції РІФ-10, непрямий метод, якісна методика.

10. Реакція імунофлуорісценції РІФ-200, непрямий метод, якісна методика.

11. Реакція імунофлуоресценції з абсорбцією (РІФ-АБС), непрямий метод, якісна методика.

12. Реакція імунофлуоресценції РІФ, кількісна методика.

Примітка: Реакції, зазначені в п.10 і 11, ставляться одночасно і обов'язково. Реакції, зазначені в п.9 і 11, ставляться по показникам, п.9 (інкубаційний період), первинний серонегативний сифіліс, пізні форми сифілісу, уроджений сифіліс, при підозрі на перенесену в минулому сифілітичну інфекцію, п.12 діагностика різноманітних форм сифілісу, якості проведеної терапії. критерій виліковності сифілісу.

13. Реакція імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною, якісна методика (РІФ-н).

14. Реакція імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною, якісна методика (РІФ-10, РІФ-200).

15. Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ), класичний або меланжерний метод, якісна методика.

16. Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ), класичний або меланжерний метод зі збільшенням об'єму досліджуваної сироватки.

17. Імуноферментний аналіз (ІФА), якісна методика.

Ця Інструкція від раніше затвердженої Міністерством охорони здоров'я СРСР у 1963 р. (наказ від 27 лютого N 86), відрізняється тим, що рекомендує вважати в реакції зв'язування комплементу РЗК (реакція Вассермана) лише кардіоліпіновий і трепонемний антигени.

Менш чутливі реакції (РЗК з ліпоідним антигеном), осадові реакції Закс-Вітебського і Кана виключені з постановки. Не використовуються і активні модифікації.

Паралельно з РЗК з кардіоліпіновим і РЗК з трепонемним антигенами обов'язково використовують і мікрореакцію преципітації з кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою. Спільне одначасне використання РЗК з кардіоліпіновим РЗК з трепонемним антигенами і мікрореакції (МР) з інактивованою сироваткою обумовлюється тим, що в сироватці хворих на сифіліс виявляють різні антитіла, МР з кардіоліпіновим антигеном приєднана до РЗК, що підвищує надійність під час виявлення сифілісу. З метою підвищення чутливості РЗК можна застосовувати методику постановки її на холоді.

Постановка РЗК і специфічних реакцій на сифіліс провадиться в централізованих серологічних лабораторіях, а також в лабораторіях лікувально-профілактичних установ дермато-венерологічного профілю.

Одержавши позитивний результат (4+, 3+) в РЗК з кардіоліпіновим антигеном, застосовують кількісну методику постановки для визначення титру антитіл у сироватці крові.

Зниження концентрації антитіл у сироватці крові. Зниження концентрації антитіл, негативація серологічних реакцій є одним з критеріїв ефективності лікування хворих на сифіліс.

Спільне використання РЗК з кардіоліпіновим і РЗК з трепонемним антигенами, МР з інактивованою сироваткою, а також ІФА повинні застосовуватися для діагностики усіх форм сифілісу, контролю ефективності лікування, обстеження осіб, що були у контакті із хворими на сифіліс, донорів, осіб, що направлені на переривання вагітності, у т.ч. у ранні строки (вакуум-екстракція), хворих гінекологічного, неврологічного, психіатричного, урологічного, проктологічного, онкологічного профілей, вагітних (не допускається заміни РЗК на ІФА або інші відбіркові реакції під час обстеження вагітних).

Постановка РЗК і специфічних реакцій на сифіліс провадиться в централізованих серологічних лабораторіях, а також в лабораторіях лікувально-профілактичних установ, які здійснюють діагностику сифілісу. Необхідність спільного одночасного використання реакції зв'язування комплементу (РЗК) з трепонемними і кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою крові, обумовлюється тим, що у сироватці крові хворих на сифіліс виявляють різні антитіла. МР з кардіоліпіновим антигеном приєднана до РЗК у зв'язку з її більшою чутливістю у порівнянні з РЗК, що забезпечується високою концентрацією кардіоліпінового антигена, необхідною для одержання преципітату, що підвищує надійність виявлення сифілісу. З метою підвищення чутливості РЗК можна застосовувати методику постановки її на холоді.

Постановка відбіркових реакцій повинна провадитися в серологічних лабораторіях, а при відсутності їх - в діагностичних лабораторіях дермато-венерологічного профілю.

Для постановки відбіркових реакцій повинні бути виділені лаборанти з вищою та середньою освітою, медичні сестри. Навчання брати кров з пальця і з вени, методику постановки і обліку результатів реакції повинне здійснюватися в серологічних лабораторіях НДІ, обласних і тих міських КВД, на які покладено функції організаційно-методичних центрів.

Взяття крові з пальця і постановку МР повинні проводити особи з середньою освітою. При їх відсутності облік результатів проводить лікар будь-якої спеціальності, який пройшов відповідну підготовку.

Організаційні питання, пов'язані з застосуванням відбіркових реакцій на сифіліс (взяття крові з вени або пальця, місце її дослідження та ін.), повинні вирішуватися органами охорони здоров'я на місцях, залежно від місцевих умов та можливостей.

За допомогою відбіркових реакцій обстежуються особи, що підлягають періодичним медичним оглядам на венеричні захворювання, хворі, що поступають на обстеження і лікування в лікувальні установи для дорослого населення, особи, яких помістили до медичних витверезників, спецприйомників, прийомників-розподільників, ізоляторів для тимчасового утримання під охороною, умовно достроково звільнених і направлених на будівництво народного господарства, а також умовно засуджених, які стоять на обліку в спецкомендатурах.

На основі позитивних результатів відбіркових реакцій діагноз сифілісу не встановлюють, обстежених направляють до дерматовенеролога і їхню кров досліджують в КЗР, РІФ, РІТ, ІФА, тобто під час профілактичних обстежень мікрореакції (МР) використовують як відбіркові, а не діагностичні.

Специфічні серологічні реакції (РІТ і РІФ) використовують для діагностики прихованих і пізніх форм сифілісу, розпізнання, хибно-позитивних результатів РЗК і МР, при клінічній, епідеміологічній і анамнестичній підозрі на сифіліс, для встановлення ретроспективного діагнозу сифілісу, а також під час контролю ефективності лікування серорезистентного сифілісу і встановлення вилікування сифілісу. Під час обстеження статевих контактів хворого на сифіліс і діагностиці первинного серонегативного сифілісу застосовують РІФ (РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АВС), оскільки при ранніх формах захворювання реагіни і іммобілізини ще не виявляються. Відсутність тих або інших антитіл може спостерігатися і при інших формах сифілісу, головним чином у пізній стадії захворювання, у зв'язку з чим паралельна постановка кількох специфічних серологічних тестів підвищує число виявлених хворих на сифіліс.

Використання різноманітних модифікацій постановки специфічних серологічних реакцій на сифіліс визначається метою дослідження. Так, на РІФ, РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АВС доцільно орієнтуватися при діагностиці ранніх форм сифілісу.

При серологічному обстеженні новонароджених дітей, при неможливості одержання крові з вени у дорослих слід використати методику постановки РІФ-АВС з капілярною кров'ю.

З метою ліквордіагностики сифілісу слід застосовувати РІФ-н і РІФ-10, при неможливості її постановки РЗК з кардіоліпіновим антигеном на холоді.

Серологічні лабораторії НДІ, обласних і міських КВД повинні здійснювати контроль якості серологічних реакцій, які застосовують у лабораторіях підвідомчих територій.

Підготовка лікарів лаборантів з методики серологічного дослідження і підвищення їхньої кваліфікації повинні здійснюватися в шкірно-венерологічних установах НДІ, обласних і міських КВД, на які покладено функції організаційно-методичних Центрів, на кафедрі венерології і лабораторної справи інститутів удосконалення лікарів.

МЕТОДИКА

постановки відбіркових мікрореакцій преципітації

Принцип: при додаванні до плазми або сироватки крові хворого на сифіліс емульсії кардіоліпінового антигену утворюється преципітат (комплекс - антиген-антитіло), який осідає у вигляді пластівців білого кольору.

Устаткування, необхідне для взяття крові з пальця і вени та постановки реакції:

1. Капілярні піпетки апарату Панченкова.

2. Градуйовані піпетки 1,2,5 і 10 мл. Пастерівські піпетки.

3. Пробірки завдовжки 8-10 см і 14-15 см., діаметром 1-1,5 см або центрифугальні.

4. Пластинки з прозорого матеріалу з лунками діаметром 1-1,2 см., завглибшки не менше 0,5 см.

5. Голки для взяття крові з пальця або вени.

6. Гумова груда.

7. Центрифуга, яка робить не менше 1000 об/хв.

8. Апарат для струшування.

9. Ваги аналітичні Т-200 4-го кл.

10. Важки аналітичні ГОСТ-7328-61 4-го кл.

1. Антиген кардіоліпіновий для мікрореакції.

2. Холін-хлорид (включається в упаковку з антигеном).

3. Хлорид натрію х.ч. (цитрат натрію).

4. Натрій лимонно-кислий (Na C H O х 5 H2O) тризаміщений.

5. Мертиолат (С Н О NaH).

1. Ізотонічний розчин хлориду натрію 1,9 %.

2. 10 % розчин холін-хлориду. Готують так: до 29.65 мл ізотонічного розчину натрію хлориду додають 0,35 мл 0,01 % розчину мертіолату і 5 мл 70 % розчину холін-хлориду.

Суміш старанно перемішують. При відсутності мертіолату для приготування 10% Розчину натрію хлориду додати 5 мл 70 % розчину холін-хлориду.

3. 5 % розчин тризамішеного цитрату натрію готують на дистильованій воді і фільтрують. Розчин не стійкий. Під час помутніння його треба замінювати свіжим.

4. Контрольні ліофілізовані сироватки крові для встановлення їхньої придатності емульсії антигена випускає Каунаське підприємство по виробництву бактерійних препаратів. Негативну і позитивну сироватки крові використовують нерозведеними, слабопозитивну одержують з позитивної шляхом її розведення.

При відсутності ліофілізованих сироваток крові використовують нативну позитивних у РЗК з кардіоліпіновим антигеном або мікрореакції інактивованих сироваток крові, які з метою економії розливають по 0,5 мл у пробірки з щільно закритими пробками і зберігають у морозильному відділені холодильника. В день постановки реакції свіжу або розморожену в одній пробірці сироватку крові титрують на пластинці для контролю якості емульсії і одержання слабопозитивного результату, який використовують потім протягом робочого дня як контроль.

Титрування сироватки крові проводять таким чином: в 9 лунок пластинки, починаючи з другої лунки, вносять по три краплі ізотонічного розчину натрію хлориду і добавляють до першої і другої лунки по три краплі позитивної сироватки крові. Вміст другої лунки перемішують Пастерівською піпеткою, насмоктуючи і випускаючи з неї в лунку 5-6 разів. Потім набирають частину вмісту другої лунки в Пастерівську піпетку і три краплі переносять до третьої лунки, а сироватку крові, що залишилася у піпетці, повертають до другої лунки. Вміст третьої лунки змішують так само і три краплі переносять до четвертої лунки. З останньої лунки три краплі вилучають. У всі лунки додають по одній краплі емульсії кардіоліпінового антигену. Пластинку струшують ручним способом або в апараті для струшування протягом 5 хвилин, додають по три краплі ізотонічного розчину натрій хлориду і залишають при кімнатній температурі на 5 хв., після цього реєструють результат. Розведення сироватки крові, що дало слабопозитивний результат (2+), використовують як слабопозитивний контроль. Для одержання його роблять відповідне розведення. Наприклад, якщо слабопозитивний результат одержано з розведенням сироватки крові 158, то для одержання контрольного розведення в пробірку вносять 0,7 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і 0,1 мл позитивної сироватки крові і перемішують, при правильно проведеному титруванні, у позитивної сироватки крові, в міру її розведення, спостерігають рівномірне зменшення величини пластівців преципітату

Під час зниження реактивності контрольної сироватки крові яка зберігається, використовують розведення, що дає слабопозитивний результат при повторному титруванні. Контрольну сироватку крові можна використовувати доти, доки вона дає позитивний результат (4+) у розведенні не нижче, ніж 1:2, і слабопозитивний результат (2+) у розведенні не менше, ніж 1:4. Під час подальшого зниження реактивності позитивну контрольну сироватку крові, що використовують, замінюють новою.

Під час зберігання контрольних сироваток крові не допускають повторні заморожування і їхнє відтанення, оскільки в цьому випадку реактивність їх знижується.

Серологічні лабораторії шкірно-венерологічних диспансерів повинні постачатися контрольними сироватками крові через аптекоуправління. При відсутності контрольних сироваток крові реакцію ставити не можна.

5. Емульсію кардіоліпінового антигена готують з спеціального кардіоліпінового антигена для мікрореакціі преципітації, що випускає Харьківське підприємство по виробництву бактерійних препаратів Міністерства охорни здоров'я України (Харків, Померки, 84).

Не можна використовувати у мікрореакції кардіоліпіновий антиген, який застосовують - реакції зв'язування комплементу.

Перед приготуванням емульсії звертають увагу на прозорість ампульованого антигену. З випадінням кристалів холестерину, їх розчиняють нагріванням ампул у термостаті при 37 град. або 56 град. С.

Перш ніж приготувати емульсію, розраховують необхідну кількість її на робочий день або рабочий тиждень (на 500 досліджень потрібно 1 мл. кардіоліпінового антигену). До пробірки вносять сухою піпеткою не більше 2 мл. антигену, додаючи його до рівного об'єму 0,9% ізотонічного розчину натрію хлориду, змішують, залишають при кімнатній температурі на 30 хв., потім центрифугують при 1000 об/хв. до одержання прозорої надосадової рідини, яку відокремлюють, а до осаду додають 3,5 об'єму (по відношенню до взяття антигена) 10% розчину холін-хлориду. Наприклад, якщо потрібний об'єм антигену дорівнює 0,5 мл., то для вирахування кількості холін-хлориду 0,5 мл. множать на 3,5 і одержують 1,75 мл., тобто необхідний об'єм холін-хлориду. Пробірку щільно закривають пробкою і вміст її збовтують, перекидаючи пробірку, до повного ресуспензування. Одержана емульсія готова до використання. При необхідності виготовлення великої кількості емульсії її готують не в одному флаконі великої місткості, а в кількох пробірках, вносячи до кожної з них по 2 мл. антигену. Такі об'єми забезпечують краще змішування антигену, запобігають його забрудненню під час повторного взяття для постановки реакції, а також від нагрівання і дії сонячного проміння.

Емульсію антигену зберігають у холодильнику при 4 град. С не більше тижня, а з додаванням розчину мертиолату - протягом 2-х тижнів. У день постановки реакції потрібну для даного робочого дня кількість емульсії беруть з холодильника залишають для зігрівання при кімнатній температурі на 30 хв. і перевіряють її придатність на контрольних сироватках крові. Емульсію, яку використовують, необхідно захищати від світла, загорнувши пробірки з нею чорним папером. Придатність кожної нової серії антигену перевіряють експрес-методом одночасно зі старою серією на явно позитивних і слабопозитивних сироватках крові. Про придатність антигену судять по величині титрів, які спостерігають під час одночасного титрування позитивних сироваток крові з новою і старою серіями антигенів. Одержання близьких результатів - тобто величин титрів реагентів, які відрізняються на +- 1 розведення, однакового виявлення пластівців преципітації, які спостерігають в одних і тих самих розведеннях позитивних сироваток крові, слабо позитивних, а також відсутність преципітації у негативній сироватці крові свідчіть про придатність серії антигена, яку досліджують. Серію антигена бракують, якщо одночасно титрування контрольної позитивної сироватки з новою серією антигена показує: а) слабовиявлений преципітат (2+, 1+) при мінімальних розведеннях сироватки крові;

б) більш низький (на 2-3-и розведення) титр преципітатів, ніж зі старої серії;

в) наявність преципітату у негативних сироватках крові.

ОДЕРЖАННЯ ПЛАЗМИ КРОВІ. Кров беруть з пальця так само, як для дослідження швидкості осаду еритроцитів (ВІОЕ). Під час взяття крові змочують капіляр апарату Панченкова 5% розчином цитрату натрію, набравши розчину до помітки "0", повертають до флакону розчин до помітки "25", а цитрат натрію, що залишився, виливають до центрифужної або вассерманівської пробірки, куди потім вносять три капіляри крові, взятої до помітки "0", змішують. Кров відстоюють при кімнатній температурі, а в зкстренних випадках центрифугують з метою одержання плазми крові (експрес-метод), яку відсмоктують пастерівською піпеткою для проведення дослідження.

ОДЕРЖАННЯ ІНАКТИВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ. Кров беруть з вени, одержують сироватку крові і інактивують її так само, як і для РЗК.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ МІКРОРЕАКЦІЇ 3 ПЛАЗМОЮ І ІНАКТИВОВАНОЮ СИРОВАТКОЮ КРОВІ

Пастерівською піпеткою насмоктують плазму або інактивовану сироватку крові і вносять по три краплі у лунки, куди потім додають одну краплю емульсії кардіоліпінового антигена. До кожної лунки вносять плазму або інактивовану сироватку крові від одного обстежуваного і нумерують її згідно зі списком у реєстраційному журналі. Інгредієнти змішують струшуванням пластинки протягом 5 хвилин, потім до кожної лунки додають по три краплі ізотонічного розчину натрію хлориду, змішують погойдуванням пластинки і залишають при кімнатній температурі на 5 хвилин (оптимальний температурний режим реакції 23-28 град. С). Результати враховують лише після з'явлення пластівців у контрольній слабопозитивній сироватці крові, але не пізніше 7-10 хвилин від з'єднання інгредієнтів.

ОБЛІК РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЙ. Результати лічать неозброєним оком і над штучним джерелом освітлення. У лунках з плазмою і сироваткою крові, які взяли від хворих на сифіліс, осідають різні за розмірами пластівці. Появу великих пластівців розцінюють як позитивний результат (4+, 3+), середньої величини і дрібних - як слабопозитивний (2+, 1+).

При негативному результаті пластівці не утворюються. У сумнівному випадку необхідно орієнтуватися на контроль негативної сироватки крові. Якщо в ньому пластівці відсутні, а у зразках плазми або сироватки крові осіб, яких обстежують утворюються дрібні пластівці, результат в цьому випадку вважають сумнівним.

КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД МІКРОРЕАКЦІЇ

Кількісний метод мікрореакції дає змогу, не подовжуючи часу постановки реакції (15-30 хв.), об'єктивніше оцінити стан обстежуваних (рівень антитіл преципітантів) і використати його як критерій оцінки у динаміці лікування хворих на сифіліс.

Розведення сироватки або плазми одержують таким чином: в усі лунки плексигласової пластини розливають апаратом Флоринського по 0,15 мл (3-й краплі по 0.05 мл) сироватки або плазми. Змішують вміст лунки першого ряду і переносять апаратом Флоринського (можна і піпеткою з балончика) до наступного ряду лунок, потім змішують вміст другого ряду і переносять до 3-го ряду. Таким чином, переносять суміш ізотонічного розчину хлориду натрію і сироватки (плазми) до 4-го, 5-го, 6-го ряду лунок пластини. З останнього ряду лунок виливають по 0,15 мл і одержують розведення сироватки або плазми 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64. Реакцію вираховують по випаденню преципітату. Титром сироватки або плазми вважають те розведення, яке дає результат на 2+.

Обстеження хворих на сифіліс та осіб з псевдохибнопозитивними серореакціями паралельно РЗК і РМП з кардіоліпіновим антигеном показало, що певному титру РЗК відповідає певний титр РМП при використанні у реакції плазми або сироватці.

Так, під час дослідження сироватки крові титру РЗК 1:5 відповідає титр РМП 1:4 (від 2 до 4), титру РЗК 1:10 (від 2 до 8), титру РЗК 1:20-титр РМП 1:6 (від 2 до 4-8), титру РЗК 1:40 - титр РМП 1:8 (від 4 до 16), титру 1:80 - титр РМП 1:12 (від 8 до 16-32), титру РЗК 1::1б0 - титр РМП 1:18 (від 8 до 32), титру РЗК 1:320 - титр РМП 1:28 (від 16 до 32-64), титру РЗК 1:640 - титр РМП 1:44 (від 16-й до 64).

Слід відзначити більш високі титри РМП з плазмою, ніж з сироваткою крові.

Як у хворих на сифіліс, так і у осіб з хибнопозитивними серореакціями крові, зі збільшенням титру РЗК, відповідно, збільшується і титр РМП.

У хворих на первинний серопозитивний сифіліс позитивна мікрореакція передує РЗК, яка стає позитивною лише з початком лікування, а у хворих на сифіліс після лікування вона нерідко залишається позитивною у титрі від 2 до 4, протягом 2-3 місяців і після негативації РЗК. Мають місце випадки, коли якісна РМП була негативною у хворих на сифіліс при позитивній РЗК у титрі 1:80 і вище, а при кількісній постановці РМП вона була позитивною у тирі від 2 до 4 і вище. Це можна пояснити тим, Що при надто великих титрах преципітинів комплекс антиген-антитіло не утворився, оскільки було мало антигену на цю кількість антитіл. Показання для постановки кількісної РМП.

1. На прийомі у лікаря для встановлення титру РМП і відповідно приблизного тиру РЗК.

2. У динаміці для оцінки якості лікування хворих на сифіліс, що проводиться.

3. У тих випадках, коли РЗК неможливо поставити з технічних причин (відсутність електроенергії, реактивів).

КОМПЛЕКС СТАНДАРТНИХ СЕРОЛОГІЧНИХ РЕАКЦІЙ (РЕАКЦІЯ ЗВТЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА)

Для виконання реакції зв'язування комплементу необхідні такі інгредієнти:

ДОСЛІДЖУВАНА СИРОВАТКА

Взяття крові проводять натщесерце або не раніше 6 годин після прийому їжі. Не можна брати кров у хворих з підвищеною температурою, після вживання спиртних напоїв раніше 24 годин, у тих, що нещодавно перенесли інфекційне захворювання, у жінок під час менструації, вагітних у останні 10 днів вагітності, породіль у перші 10 днів після пологів, новонароджених у перші 10 днів життя.

Кров з ліктьової вени у кількості 8-10 мл беруть у суху чисту пробірку. Пункцію проводять стерильною голкою, дотримуючись правил асептики. У грудних дітей кров беруть з надрізу вузьким скальпелем п'ятки.

До лабораторії кров має бути доставлена не пізніше 24 годин з моменту взяття при умові її зберігання у холодильнику при температурі 4 град. С.

Доставлену до лабораторії кров одразу після взяття вміщують у термостат на 15-30 хвилин при температурі 37 град. С. Згусток, що утворився, відділяють скляною паличкою від стінок пробірки і центрифугують 15 хвилин при 1000 об/хв. Над згустком утворюється прозора сироватка, яку за допомогою піпетки з гумовим балоном без домішки еритроцитів переносять у іншу пробірку. При наявності у сироватці крові домішки еритроцитів її центрифугують і зливають.

Кров, доставлена до лабораторії напередодні постановки реакції, обводять скляною паличкою і ставлять у холодильник при температурі 4 град. С. Перед постановкою реакції сироватку, що утворилася над згустком крові, переносять до іншої пробірки. Сироватка не повинна бути використана для постановки реакції у день взяття крові, лише через 24 години.

Зняту зі згустку сироватку інактивують у сухоповітряному інактиваторі або водяній бані протягом 30 хвилин при температурі 56 град. С для знищення природного комплементу і стабілізації глобулінових фракцій досліджуваної сироватки крові.

Інактивовані сироватки можуть зберігатися у морозилці холодильника протягом 5-6 днів. Сироватки, інактивовані напередодні, в день поставки реакції повинні бути повторно прогріті протягом 15 хвилин при температурі 56 град. С. Активні сироватки можуть зберігатися у морозилці холодильника протягом 1-го місяця (не допускаючи розморожування).

Реакція Вассермана повинна ставитися з двома антигенами: ультразвуковим трепонемним і кардіоліпіновим.

Ультразвуковий трепонемний антиген готують з культур блідих трепонем, вирощених у пробірці, підданих дії ультразвуку.

Ультразвуковий трепонемний антиген випускають ліофільно висушеним у флаконі по 5-10 мл: зберігають його у холодильнику при температурі 4 град С.

Строк придатності антигену вказано на етикетці. Антиген розчинюють і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду відповідно об'єму і титру, вказаному на етикетці флакона. Попередньо перед розведенням по титру необхідно збовтати завись протягом 30 хвилин. Цим досягають усунення парадоксальних результатів.

Кардіоліпіновий антиген для реакції Вассермана є очищеним від баластових сумішей спиртовий екстракт ліпідів з мускулів бичачого серця. Активність антигену обумовлена присутністю трьох компонентів - фосфоліпіду, лецетину і холестерину.

Кардіоліпіновий антиген випускають у ампулах по 2-а мл; зберігають його у темному місці при температурі не нижче 15-18 град С. Строк придатності антигену вказано на етикетці.

Перед вживанням антиген з ампули переносять у суху чисту пробірку, щільно закривають корковою або притертою скляною пробкою.

В разі випадання кристалів холестерину, антиген необхідно прогріти на водяній бані при температурі 56 град. С або у термостаті при температурі 37 град. С до повного розчину кристалів.

Для постановки реакції антиген розводять відповідно титру, указаному на етикетці ампули. Розведений антиген має бути злегка опалесцюючим, але не каламутним.

Титр - це кількість чистого антигену в 1-ому мл розчину. Наприклад, якщо титр ультразвукового трепонемного антигену 0,05, то для приготування 10 мл розведеного по титру антигену потрібно взяти 0.5 мл антигену і 9,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду.

Подвійні дози антигенів не повинні володіти гемотоксичністю (гемоліз у відсутності комплементу), що установлюють відповідним контролем антигену при титруванні комплементу. Антигени не повинні бути антикомплементарними (придушення гемолізу), що також установлюють при паралельному титруванні комплементу без антигенів і в присутності антигенів, які застосовують у реакції зв'язування комплементу.

Розведені по титру антигени вводять у реакцію в кількості 0,5 мл під час роботи в об'ємі 1,25 мл.

ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКИ (ГЕМОЛІЗИН)

Ця сироватка кролика або осла, імунізована еритроцитами барана.

Гемолітичну сироватку (рідна або суха) випускають в ампулах по 1 мл, вказуючи титр. Для розчинення сухого гемолізину в ампулу додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Гемолітичну сироватку як суху, так і розчинену зберігають у холодильнику при температурі 4 град. С. Строк придатності сухої гемолітичної сироватки вказано на етикетці.

Титр гемолітичної сироватки, яку застосовують для реакції, не повинен бути нижче 1:1200. Визначення титру проводять за такою схемою: готують основне розведення (0,1 мл гемолітичної сироватки + 9,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду), з якого роблять відповідні розведення (табл. N 1).

СХЕМИ РОЗВЕДЕНЬ ГЕМОЛІЗИНУ

Потім у ряд інших пробірок відмірюють по 0,5 мл раніше приготовлених розведень гемолітичної сироватки, починаючи з 1:1000, додають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і 0,5 мл комплементу (комплемент у розведенні 1:10), а також 0.5 мл 3 % суспензії еритроцитів барана (табл. N 2), пробірки ставлять у термостат лри температурі 37 град. С на 1-у годину, періодично струшуючи.

ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ ГЕМОЛІЗИНУ

Титром гемолітичної сироватки є найвище її розведення, що дало повний розчин 5 мл, 3% зависі еритроцитів барана у присутності комплементу. В даному випадку титр гемолітичної сироватки 1:1 (табл. N 2).

Для основного досліду І титрації інгредієнтів беруть розведення, підсилене проти одержаного титру втричі (потрійний титр). У даному прикладі 1:500 (0,1 на 50).

ЕРИТРОЦИТИ БАРАНА

Кров беруть у барана шляхом пункції яремної вени не частіше 1-го разу за 10 днів, у кількості не більше 200 мл. Баран має бути у віці від 1-го до 5-ти років. Кров беруть у стерильну банку зі скляним намистом, яку струшують протягом 5-10 хв., потім кров фільтрують через подвійний шар марлі (відокремлюють згустки ниток фібріну, що утворилися).

Перед постановкою реакції еритроцити барана триразове відмивають ізотонічним розчином натрію хлориду шляхом центрифугування. Центрифугують 10 хв. при 1,5 тис. об/хв. Остання порція промивної рідини повинна бути безбарвною, надосадову рідину зливають; при наявності гемолізу еритроцити барана непридатні до вживання.

З щільного осаду еритроцитів готують 3 %, завись еритроцитів у ізотонічному розчину натрію хлориду (на 3 мл щільного осаду еритроцитів додають 97 мл ізотонічного розчину натрію хлориду).

Дефібриновану кров зберігають протягом 5-7 днів у холодильнику при температурі +4, +8 град. С.

Нерозведена дефібринована не відмита кров барана зберігається довше, ніж відмиті еритроцити.

Для збереження на значно довші строки рекомендують консервувати дефібриновану кров барана по методу Мигуліної. До 100 мл дефібринованої крові барана додають 15 мл суміші, приготованої за таким прописом: глюкози - 6,0 г, борної кислоти - 4,5 г. 100 мл ізотонічного розчину натрій хлориду; приготовлену суміш кип'ятять на водяній бані 3-й дні підряд по 20 хв. Консервована кров барана по методу Мигуліної придатна для використання протягом 3-4 тижнів. Перед постановкою реакції при використанні консервованої крові еритроцити необхідно відмивати ізотонічним розчином натрію хлориду.

КОМПЛЕМЕНТ

Застосовують суміш сироваток крові, одержаної пункцією серця у 5-10 здорових морських свинок. Кров для кращого зсідання ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 30 хв. Після утворення згустка, останній відділяють від стінок пробірки, яку вміщують у холодильник при температурі 4 град. С до наступного дня. Одержану прозору сироватку зливають і використовують як комплемент. Активність цього комплементу при зберіганні у холодильнику при температурі 4 град.С не змінюється протягом 1-2 діб.

Під час консервування сухої борної кислоти і сірчанокислотним натрієм комплемент зберігається у холодильнику при температурі 4 град. С 1-2 місяці (4,0 борної кислоти +5,0 г сірчанокислотного натрію на 100 мл комплементу).

Може бути використаний ліофільно висушений комплемент. Сухий комплемент випускають у ампулах по 1 мл. Розчинення сухого комплементу проводять у день постановки реакції ізотонічним розчином натрій хлориду при легкому струшуванні. В ампулу з сухим комплементом додають 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Потрібна для постановки реакції кількість комплементу змішують з кількох ампул єдиної серії.

Безпосередньо перед постановкою реакції Вассермана проводять титрування комплементу в присутності всіх інгредієнтів, що беруть участь у досліді.

Комплемент титрують обов'язково: а) у чистому вигляді (без антигенів), тобто у присутності лише гемолітичної системи і б) з усіма антигенами, що входять у дослід. Титрування комплементу проводять також у присутності інактивованої негативної сироватки крові людини.

При титруванні комплементу інгредієнти розводять у такому порядку:

1. Розводять гемолітичну сироватку по потроєному титру в ізотонічному розчині натрію хлориду.

2. З щільного осаду еритроцитів готують 3% завись в ізотонічному розчині натрію хлориду.

3. Розливають 3% завись еритроцитів барана та ізотонічній розчин натрію хлориду в 5 контрольних пробірок і розведену по потроєному титру гемолітичну сироватку (в другий контроль) табл. N 3.

4. Готують гемолітичну систему: розчин гемолітичної сироватки, розведений і по потроєному титру, приливають до рівного об'єму 3 % зависі еритроцитів барана і швидко перемішують, переливаючи з однієї колби в іншу.

5. Розводять антигени ізотонічним розчином натрі хлориду по вказаному на етикетці титру.

6. Розводять свідомо негативну інактивовану сироватку крові людини в співвідношенні 1:5 (2 мл сироватки + 8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду).

7. Розводять комплемент 1:10 (1 мл комплементу + 9 мл ізотнічного розчину натрію хлориду).

СХЕМА ПРОВЕДЕННЯ КОНТРОЛЮ

ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ОБ'ЄМІ 1,25 МЛ

Титрування комплементу проводять в 33 пробірках, поставлених по 11 шт. у три ряди. Два ряди пробірок для титрування комплементу в присутності двох антигенів і третій ряд - для титрування комплементу без антигенів "per se". П'ять контрольних пробірок: дві для контролю антигенів і по одній - для контролю комплементу, гемолітичної сироватки і ізотонічного розчину натрію хлориду на гемотоксичність заповнюють до об'єднання розчин гемолітичної сироватки і зависі еритроцитів барана (табл. N 3).

Комплемент розведений 1:10, розливають у 10 пробірок першого ряду в дозах (0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,56; 0,6). Загальний обсяг вмісту пробірок доводять до 1-го мл відповідними об'ємами ізотонічного розчину натрію хлориду: 0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,44; 0,4. Одержану в кожній пробірці суміш старанно перемішують і переносять по 0,25 мл а два рада пробірок, що стоять позаду. Потім в усі 33 пробірки розливають по 0,25 мл інактивованої негативної сироватки крові людини, розведеної ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5. Далі в 11 пробірок першого ряду приливають по 0,25 мл розведеного по титру трепонемного антигену; розведений по титру кардіоліпіновий антиген приливають по 0,2 мл в 11 пробірок другого ряду; ізотонічний розчин натрію хлориду приливають по 0,25 мл в 11 пробірок третього ряду.

Штатив пробірок струшують і додають по 0,5 мл гемолітичної системи в третій рад пробірок (без антигена), штатив з пробірками знову струшують і ставлять на 45 хвилин у термостат при температурі 37 град. С. Після інкубації в термостаті в 22 пробірках першого і другого рядів добавляють по 0,5 мл гемолітичної системи. Зміст пробірок знову струшують і ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин. Як мине 45 хвилин, визначають робочу дозу комплементу в присутності антигенів, до якого роблять надбавку в межах 15-30% (в середньому 20 %) в залежності від проходження гемолізу. Враховують також титр комплементу без антигенів "per se".

Титром комплементу є його найменша кількість, що сприяє повному гемолізу еритроцитів барана в присутності антигену і негативної сироватки людини.

У даному випадку титр комплементу буде 0,3, а робоча доза комплементу - 0,36, тобто 3,6 % (табл. N 4).

МЕТОДИКА

постановки реакції Вассермана

Принцип реакції: реагіни, що є у сироватці крові хворих на сифіліс, мають властивість вступати в з'єднання з кардіоліпіновим антигеном. Специфічні антитрепонемні антитіла вступають в з'єднання з специфічними антигенами (ультразвуковий трепонемний антиген).

Комплекси, що утворилися, сорбують комплемент, який вводять у реакцію. Індикація комплексів, що утворилися, досягається введенням гемолітичної системи гемолітична сироватка + еритроцити барана).

ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ПРИСУТНОСТІ АНТИГЕНУ І НЕГАТИВНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ ЛЮДИНИ

Примітка: -Г - затримка гемолізу, +Г - гемоліз.

ЯКІСНА РЕАКЦІЯ. У день постановки досліду проводять підготовчу роботу (зливання досліджуваних сироваток крові, її згусток, інактивація їх, відмивання еритроцитів барана від плазми, приготування ізотонічного розчину натрію хлориду).

Розводять інгредієнти: гемолітичну сироватку, еритроцити барана, антигени по титру, проводять титрування комплементу без антигенів для визначення його робочої дози.

ВИТРАТИ ІНГРЕДІЄНТІВ НА 100 ДОСЛІДЖЕНЬ

Якісну реакцію (табл. N 5) для кожної досліджуваної сироватки крові проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Водночас ставлять для контролю свідомо позитивну і слабопозитивну (4+, 2+) і негативну сироватку крові. Ковну досліджувану інактивовану сироватку крові, розведену 1:5 ізотонічним розчином натрій хлориду, розливають по 0,25 мл у три пробірки, з яких третя е контролем. До першої пробірки додають 0,25 мл трепонемного антигену, до другої - кардіоліпінового антигену, розведених по титру. До третьої (контрольної) - 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Комплемент, розведений по робочій дозі, додають по 0,25 мл в усі дослідні і контрольні пробірки. Попереднє змішування антигену і комплементу не рекомендують. Після первинної 45-хвилинної інкубації у термостаті при температурі 37 град. С додають в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи. Легким струшуванням змішують зміст пробірок і ставлять їх у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин до настання гемолізу в контрольній пробірці. Реєструють результат реакції з антигенами гемолізу при наступі гемолізу в дослідних пробірках.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ЯКІСНОЇ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати реакції Вассермана оцінюють таким чином: повна або значна затримка гемолізу - +4, +3 позитивна реакція); часткова затримка гемолізу - +2 (слабопозитивна реакція); незначна затримка гемолізу - +1 - сумнівна реакція - -1, повний гемоліз - негативна реакція.

Оцінку результатів реєструють у книзі протоколів лабораторії хрестами, а результати видають словами - позитивний, слабопозитивний, сумнівний, негативний. Результат реакції слід давати по кожному антигену окремо. У випадку розходження результатів між антигенами необхідно проаналізувати правильність постановки реакції. При затримці гемолізу в контролі сироватки (третя пробірка, що не містить антигену), необхідне повторне дослідження з сироваткою, взятою з дотриманням правил забору крові, і при наступному антикомплементарному результаті (затримці гемолізу в контролі) необхідне розтитрування по схемі. Правильність протікання досліду оцінюють на основі результатів досліджуваних контролів:

а) контролю кожної сироватки крові - третій ряд пробірок (наявність гемолізу);

б) контролі досліду: свідомо негативної сироватки крові (гемоліз в усіх трьох пробірках); свідомо слабопозитивної сироватки (часткова затримка гемолізу [2+] в двох пробірках з антигенами і гемоліз у третій контрольній пробірці без антигена); свідомо позитивної сироватки - затримка гемолізу в двох пробірках з антигенами і гемоліз у третій пробірці (без антигенів).

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

Невірно вибрана доза комплементу (надлишок або нестача у досліді).

Неправильне зберігання досліджуваної сироватки крові.

Тривале зберігання досліджуваної сироватки крові.

Зберігання крові більше 24 годин на згусток.

КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

Кожна сироватка, що дала затримку гемолізу на 4+, 3+ з кардіоліпіновим антигеном, в тій самій постановці досліду повинна бути досліджена кількісним методом (дослідження кількостей сироватки, що зменшується, при розведенні ізотонічним розчином хлориду натрію) для визначення титру реагинів (від 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640).

Кожну сироватку крові досліджують у 8 пробірках. У першу пробірку наливають 0,8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, з другої по восьму пробірку - по 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. До першої пробірки вносять 0,2 мл досліджуваної сироватки крові, вміст змішують, потім 0,25 мл забирають, а по 0,25 мл з переносять до другої і восьмої пробірок. Після змішування переносять 0,25 мл з другої пробірки у третю, з третьої у четверту і т.д. до сьомої пробірки, з якої 0,25 мл розведеної сироватки крові вилучають. Потім приливають по 0,25 мл кардіоліпінового антигену, розведеного по титру з першої по сьому пробірки. Після легкого струшування в усі пробірки приливають по 0,25 мл комплементу, розведеного за робочою дозою. Первинна інкубація у термостаті при температурі 37 град. С триває 45 хвилин, після чого до всіх пробірок приливають по 0,5 мл гемолітичної системи. Струсивши пробірки, їх вміщують у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин і після настання гемолізу у восьмій (контрольній) пробірці реєструють результати реакції.

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ. Титром реагинів досліджуваної сироватки є розведення, яке дало повну затримку гемолізу -+4 або значну затримку гемолізу - +3.

В аналізах, які видає лабораторія, при наявності позитивної реакції вказують, з яким титром досліджуваної сироватки одержано позитивну реакцію. Наприклад: 1:10 - 4+, 1:20 - 4+, 1:40 - 4+, 1:80 - 4/3+, 1:160 - 2+ - відповідь сироватка позитивна у титрі 1:80.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ КІЛЬКІСНОГО МЕТОДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

Кількісне визначення реагинів має значення при оцінці ефективності протифілітичного лікування. Швидке зниження титру реагинів свідчить про успіх терапії. Титр реагинів, що довго не знижується, вказує на відсутність ефективності терапії і необхідність її зміни.

РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ

Принцип. У спинномозковій рідині хворого на сифіліс можуть бути антитіла. реагіни, здатні вступати в реакцію зв'язування комплементу з відповідними антигенами. Реакцій ставлять з непрогрітою спинномозковою рідиною через відсутність в ній комплементу. Каламутну або з домішкою крові рідину центрифугують зливають з осаду.

Спинномозкову рідину паралельно досліджують у трьох дозах:

2. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:2.

3. Розведену ізотонічним розчином натрію хлориду 1:5.

Реакцію проводять з двома антигенами: трепонемним і кардіоліпіновим паралельно з кожним розведенням за схемою.

Через відсутність антикомплементарних властивостей спинномозкової рідини для дослідження комплемент в реакцій вводять по титру (перша доза, що розчинює, без звичайної надбавки) (табл. N 7).

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Результати реакції враховують окремо для кожного антигену і розведення спинномозкової рідини. Результати реакції Васермана з спинномозковою рідиною оцінюють таким чином: повна і значна затримка гемолізу 4+, 3+ позитивна реакція; часткова затримка гемолізу 2+ - слабопозитивна реакція; незначна затримка гемолізу 1+ - сумнівна реакція; гемоліз - негативна реакція.

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

1. Невірний вибір дози комплементу-відсутність або надлишок комплементу.

2. Неправильне зберігання спинномозкової рідини.

3. Тривале зберігання спинномозкової рідини.

МІКРОРЕАКЦІЯ ПРЕЦИПІТАЦІЇ З ІНАКТИВОВАНОЮ СИРОВАТКОЮ І КАРДІОЛІПІНОВИМ АНТИГЕНОМ (ТИПУ ВДРЛ) - див. методику постановки відбіркових мікрореакцій преципітації.

РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ

Якісну реакцій для кожної досліджуваної сироватки крові проводять у трьох пробірках з двома антигенами. Кожну інактивовану сироватку крові, розведення 1:5 ізотонічним розчином хлориду натрію, розливають по 0,25 мл у три пробірки: до першої додають 0,25 мл трепонемного антигену, до другої - кардіоліпіновий антиген, Розведений за титром, до третьої контрольної - 0,25 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Легким струшуванням змішують вміст пробірок і витримують при температурі 18-20 град. С 10 хвилин. Потім в усі пробірки додають комплемент 0,25 мл, (робочу дозу комплементу для РЗК на холоді вираховують з 50% надбавкою в робочій дозі. одержаній під час титрування комплементу для РЗК в умовах термостату). Міст пробірок знову струмують і разом з гемолітичною системою ставлять у холодильник на 15-20 годин при температурі 4 град. С.

СХЕМИ ДОСЛІДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ

Наступного дня зміст пробірок і гемолітичну систему витримують при кімнатній температурі 15 хвилин. Після чого додають в усі пробірки по 0,5 мл гемолітичної системи, знову струшують і вміщують у термостат при температурі 37 град. С на 45-60 хвилин. Облік результатів реакції проводять після настання гемолізу в контрольній пробірці досліджуваної сироватки. Ступінь затримки гемолізу відмічають у журналі плюсами, як і під час постановки РЗК в умовах термостату (табл. N 8).

РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ

Результати реакції слід давати по кожному антигену окремо. Реакцію зв'язування комплементу на холоді рекомендують при підозрі на сифіліс первинний серонегативний, прихований, третинний, уроджений, а також під час атипових клінічних проявах захворювання.

РЕАКЦІЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ (РІТ)

ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати блідими трепонемами рухливості у присутності іммобілізуючих протитрепонемних антитіл досліджуваної сироватки і комплементу в умовах анаеробіозу.

Постановці реакції попереджує підготовча робота.

ОБРОБКА ЛАБОРАТОРНОГО ПОСУДУ

Весь лабораторний посуд (піпетки, пробірки, флакони та ін), яки використовують для постановки реакції іммобілізації трепонем, має бути стерильним. Перед стерилізацією його миють без застосування дезинфікуючих засобів. Для цього після досліду пробірки і флакони занурюють і з доданням прального порошку типу "Лотос" у воду кімнатної температури кип'ятять протягом 40 хв., охолоджують до 40 градусів і миють водопровідною, спочатку теплою, а потім холодною водою, наливаючи її у кожну пробірку 5-7 разів, після чого один раз промивають дистильованою водою і висушують у сушильній шафі. Висушений посуд загортають у папір і стерилізують автоклавуванням протягом 1 години при 1,5 атмосферах. Після стерилізації посуд знову висушують у сушильній шафі і зберігають у шафі у боксі протягом 7 днів.

ОДЕРЖАННЯ ДОСЛІДЖУВАНОЇ СИРОВАТКИ ТА ЇЇ ОБРОБКА

Перед взяттям крові обстежуваний не повинен одержувати медикаментами, що трепонемоцидно впливають на бліді трепонеми, особливо препарати пеніциліну, трихопол і ін. Прийом препаратів відміняють на строк (3-4 тижні) їхньої можливої затримки у організмі. Під час використання пеніцилінази припинення введення препаратів пеніциліну не обов'язкове.

Кров для реакції беруть з ліктьової вени натщесерце стерильно у суху, хімічно чисту і стерильну пробірку. Шкіру ліктьового згину перед прооколом протирають не спиртом, а ефіром. Взяту кров обробляють так само, як і для реакції Вассермана, але з дотриманням умов стерильності. В реакції використовують сироватку, інактивовану протягом 30 хв. на водяній бані при 56 град. С. При необхідності повторного дослідження однієї і тієї ж сироватки інактивування проводять повторно, зле протягом 15 хвилин. Перед дослідженням сироватку можна зберігати у холодильнику протягом 10-15 днів при температурі 10-20 град. С, а при температурі 4 град. С протягом 5 днів. Ніяких консервантів до сироватки не додають. При необхідності транспортування стерильно зняту зі згустку сироватку наливають в окрему ампулу, запаюють і пересилають до лабораторії РІТ.

СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИЖИВАННЯ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

Період від моменту постановки реакції до реєстрації її результатів триває 20 годин, тому для збереження життєздатності і хорошої рухливості мікроорганізмів необхідне середовище виживання. Рекомендують середовище N 2 ЦКВІ. Для приготування середовища беруть 50 г яловичого або кролячого м'яса відокремлюють від жиру і сухожилля, подрібнюють, заливають 100 мл водопровідної води і ставлять у холодильник на 24 години при 4 град. С для екстрагування. Наступного дня кип'ятять протягом 10 хвилин кроляче м'ясо і 20 хвилин яловичину, охолоджують і фільтрують через багатошаровий паперовий фільтр. Після фільтрування установлюють РН 7,2-7.4, додаючи 20% розчину їдкого натрію. Приготовлене середовище стерилізують автоклавуванням протягом 30 хвилин при 2 атмосферах і ампулують. При умові збереження стерильності середовище придатне для використання протягом 12 місяців. Ампули з середовищем зберігають у холодильнику при 4 град. С. Кожну нову партію середовища попередньо порівнюють зі старою, з якою вже проводили досліди.

КОМПЛЕМЕНТ

Реакція іммобілізації протікає лише при умові надлишку комплементу. В реакції застосовують свіжий комплемент морської свинки. Кількість його значною мірою залежить від середовища вживання блідих трепонем. При використанні середовища N 2 ЦКВІ в мікроанаеростатному методі кількість комплементу становить 27 % від загального об'єму реагентів, які використовують у реакції, а при постановці в меланжерах 40%.

Для одержання комплементу кров беруть обов'язково у кількох морських свинок так само, як для реакції Вассермана, але з дотриманням умов стерилізації. Після одержання сироватки, її наливають у стерильні пробірки по 1-4 мл і досліджують на стерильність. Для цього 1 мл сироватки морської свинки залишають у термостаті при 37 град. С на добу. У випадку бактеріального забруднення комплемент бракують. щ Пробірки з комплементом зберігають у холодильнику при -10 град. С протягом 2-3 тижнів. Повторно заморожування і відтанення не рекомендують. Не можна застосовувати в реакції іммобілізації блідих трепонем консервований комплемент, оскільки він токсичний для мікроорганізмів.

Ліофільно висушений без консерванту комплемент морської свинки може бути використаний в реакції, але за якістю він гірший від свіжого.

АНТИГЕН

Як антиген в реакції використовують завись блідих трепонем з раннього орхіту кролика (7-9 доба після зараження). Використовують бліді трепонеми штама Нікольса, які щотижнево пасерують на кроликах. Заражених кроликів тримають у світлих приміщеннях, які провітрюються. Годують повноцінною їжею, яка містить вітаміни (морква обов'язкова). Для зараження слід брати здорових кроликів-самців вагою 2,5-3 кг з негативними результатами серологічних реакцій на сифіліс (РЗК і РІТ). За 1-2 доби до зараження у кроликів вистригають шерсть у нижній частині живота, внутрішній поверхні стегна і мошонки. Для одержання раннього специфічного орхіту кролика заражують введенням у середину кожного яєчка по 1 мл зависі блідих трепонем. У зависі повинно бути більше 500 мікроорганізмів у кожному полі зору мікроскопа при використанні окуляра 7х і об'єктиву 40х.

Введення тваринам кортизону для придушення імуногенезу хоч і не є суворо обов'язковим, але застосування його дозволяє збільшити в орхіті числа блідих трепонем. Кортизон вводять внутрішньом'язово в дозі 20 мг перед зараженням і в наступні дні по 10 мг.

З появою орхіту засвідчують збільшення розмірів яєчка і ущільнення його. Для видалення яєчок кролика прив'язують до станка, обезкровлюють пункцією серця, якщо кролик при цьому не гине, його забивають повітряною емболією - введенням 20 мл повітря у серце або вену вуха. Яєчко виводять через паховий канал в мошонку, поглажуючи по животу від середини вниз до мошонки. Поверхню шкіри мошонки накривають стерильною гумовою серветкою з розрізами, через які виводять яєчка. Шкіру мошонки над яєчками протирають тампоном, змоченим ефіром, піднімають її пінцетом спочатку над одним яєчком і роблять розріз ножицями, через який виводять яєчко разом з оболонкою, відрізають його біля основи ножицями і вміщують у стерильну чашку Петрі. Далі в умовах боксу кожне яєчко звільняють від оболонок, придатки і жиру. Вміщують у стерильний бокс, розрізають на 10-15 частин, заливають 5 мл ізотонічним розчином хлориду натрій і одержану завись досліджують під мікроскопом у темному полі зору на наявність блідих трепонем. Для цього на предметне скло пастерівською піпеткою наносять по краплі рідини з кожного яєчка. При наявності трепонем шматочки яєчок разом з середовищем з середовищем з бюксу переносять у флакон місткістю 50 мл і струшують у струшувачі для вимивання мікроорганізмів з тканини яєчок. Час струшування залежить від числа виявлених мікроорганізмів. При наявності 5-10 блідих трепонем у полі зору струшування триває протягом години, а при наявності 30-40 - лише 20-30 хвилин. Після струшування зміст флакону переносять у стерильну центрифужну пробірку і центрифугують протягом 5 хвилин при 1000 об/хв для осідання еритроцитів і шматочків тканини яєчок. Надсадову рідину переносять у іншу стерильну пробірку і з неї готують препарати на предметному склі, які досліджують у темному полі (як уже було описано), визначаючи приблизно число блідих трепонем у кількох полях зору.

Завись блідих трепонем, яку тримають у пробірці, набирають у шприц і заражують підготовлених кроликів, вводячи завись у середину кожного яєчка.

Для приготування антигену завись блідих трепонем розводять стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію так, щоб у полі зору було 10-15 мікроорганізмів. Наприклад, якщо у зависі є 1000-1500 мікроорганізмів у кожному полі зору, тобто трепонеми густо вкривають усе поле зору, то на 9,9 мл середовища добавляють 0,61 мл зависі трепонем, одержують розведення в 100 разів.

ГЕМОЛІТИЧНА СИСТЕМА

МЕТОДИКА ПРИГОТУВАННЯ. Дефібровану баранячу кров або еритроцити барана в об'єкт, необхідному для роботи на даний день, центрифугують, плазму зливають, а осад тричі відмивають 6-7 об'ємами фізіологічного розчину. Під час останнього промивання надосадова рідина повинна бути безбарвною. З щільного осаду готують зависі еритроцитів барана в ізотонічному розчину хлориду натрію. Рівний об'єм гемолітичної сироватки, розведеної в ізотонічному розчині хлориду натрію за потроєним титром, наприклад, якщо на етикетці вказаний титр 1:1200, то для розведення буде 1:400, тобто 0,1 мл на 40 мл фізіологічного розчину об'єднують з 1 % зависсю еритроцитів барана. Розчин гемолітичної сироватки приливають до зависі еритроцитів барана і швидко змішують. Одержану гемолітичну систему витримують у термостаті 30 хвилин при температурі 37 град. С.

ОСНОВНИЙ ДОСЛІД

Роботу по постановці реакції проводять у боксі. Кожну сироватку досліджують у двох пробірках-дослідній і контрольній. В обидві пробірки вносять по 0,05 мл досліджуваної сироватки і по 0,35 мл антигену. До дослідної пробірки наливають 0,15 мл активного комплементу, а до контрольне і таку саму кількість інактивованого комплементу. Після заповнення зміст пробірок змішують легким струшуванням і вміщують у мікроанаеростат.

З мікроанаеростату за допомогою вакуумного насосу видаляють атмосферне повітря і заповнюють його газовою сумішшю з балону, в якому міститься азот (95 частин, і вуглекислий газ (5 частин)). Під час заповнення мікроанаеростатів газовою сумішшю стежать за тим, щоб стрілка манометру не опускалася до нульового рівня. У цьому випадку вдається уникнути підвищення тиску всередині анаеростату, який спостерігається при переміщенні його з кімнати, де температура 35 град. С, а також дозволяє стежити за герметичністю цього приладу. Мікроанаеростат з пробірками вміщують у термостат при температурі 34-35 град. С на 18-20 годин.

Під час постановки реакції використовують 5 контрольних досліджень свідомо позитивної і негативної сироваток з попереднього досліду, активного і інактивованого комплементу і середовища виживання для блідих трепонем. Контрольну негативну сироватку застосовують для висновку про ступінь рухливості блідих трепонем у даному досліді. Контрольну позитивну сироватку для оцінки ступеня імобілізуючої активності в умовах даного досліду. Сироватки досліджують за вище описаною методикою. Дослідження активного і інактивованого комплементу і середовища проводять для ви значення їхнього впливу на рухливість блідих трепонем (табл. N 9).

СХЕМИ РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

Розливання інгредієнтів під час постановки реакції проводять у боксі, попередньо опроміненим бактерицидною кварцовою лампою протягом 45-60 хвилин.

Оцінку одержаних результатів проводять через 18-20 годин. Пробірки виймають з термостату і мікроанаеростату і розставляють у штативі попарно (дослідна і контрольна). З кожної пари пробірок пастерівською піпеткою наносять краплі на про нумероване відповідно дослідним пробіркам предметне скло, накривають накривним склом 20 х 20 мм і досліджують у темному полі мікроскопа при збільшенні: об'єктив 40х, окуляр 10х. Переглядають кілька полів зору в різних ділянках препарату, підраховуючи у кожній число рухливих і нерухливих блідих трепонем. Підрахунок подають з препарату з контрольної, а потім з дослідної пробірок. У препараті підраховують не менше 25 трепонем і відмічають скільки з них рухливих і скільки нерухливих.

Якщо у дослідному препараті міститься 13-19 рухливих блідих трепонем, то для одержання більш достовірного результату необхідно полічити не 25, а 50 мікроорганізмів, також відмічено серед них число рухливих і нерухливих.

При підрахунку 50 блідих трепонем одержане число рухливих мікроорганізмів ділять на 2.

Якщо в контрольному препараті міститься менш 17 рухливих трепонем з 25 полічених, то такий дослід не придатний, і дослідження даної сироватки слід повторити. У контрольних пробірках з інактивованим комплементом відсутність рухливих трепонем пояснюється токсичністю досліджуваної сироватки крові частіше за все внаслідок домішок медикаментів, іноді бактеріальним забрудненням і ін.

При визначенні рухливості блідих трепонем слід звертати увагу на інтенсивність рухів, здійснюваних блідими трепонемами. У блідої трепонеми не завжди можна спостерігати згинальні і контрактильні рухи, іноді лише обертальні. Слід також уміти відрізняти активні рухи трепонем від руху з струмом рідини.

Розрахунок проценту специфічної іммобілізації блідих трепонем проводять за такою формулою:

В - число рухливих блідих трепонем у дослідній пробірці,

Х - процент іммобілізації.

У практичній роботі процент іммобілізації визначають заздалегідь складеній таблиці з застосуванням вищенаведеної формули. Реакція іммобілізації вважається негативною, коли процент іммобілізації коливається у межах 0-20, сумнівною від 21 до 30, слабопозитивною - від 31 до 50 і позитивною - вище 50. Сироватки з сумнівними і слабопозитивними реакціями потребують у повторному дослідженні для одержання більш достовірних результатів. Доцільно також повторювати Дослідження всіх сироваток, які дали повне розходження результатів з результатами стандартних серологічних реакцій. Ці сироватки заслуговують особливої уваги, оскільки в цих випадках результати реакції іммобілізації блідих трепонем дають можливість судити про наявність або відсутність сифілісу у обстежуваної особи.

ВИЗНАЧЕННЯ ПРОЦЕНТУ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

ПРИМІТКА: Відповідь знаходять у точці перетину горизонтального рядка з вертикальним стовпчиком, наприклад: 23 рухливі трепонеми у контрольній пробірці і 10 рухливих трепонем у дослідній пробірці відповідають 54% іммобілізації блідих трепонем.

Встановлення залишкового комплементу необхідно для визначення чи достатня була кількість комплементу у дослідних пробірках, чи не була рухливість блідих трепонем обумовлена відсутністю комплементу, внаслідок чого іммобілізації не могли проявити свою активність.

Після реєстрації результатів реакції іммобілізації блідих трепонем у вмісті пробірок визначають залишковий комплемент, додаванням до кожної пробірки гемолітичної системи в об'ємі 0,1 мл.

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

1. Токсичність досліджуваної сироватки.

2. Бактеріальне забруднення досліджуваної сироватки або комплементу.

3. Недостатня кількість комплементу у досліді.

4. Порушення герметичності мікроанаеростату, проникнення до нього кисню атмосферного повітря.

5. Підвищення або зниження температури у термостаті протягом реакції.

6. Кислотність або лужність лабораторного посуду, яким користуються під час реакції.

7. Використання медикаментів, що бактерицидно впливають на рухливість блідих трепонем.

ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ

1. Диференціювання позитивних результатів стандартних серологічних реакцій на сифіліс. Стандартні серологічні реакції дають деяку кількість позитивних результатів при захворюваннях, які не мають відношення до сифілісу. Це так звані хибнопозитивні і неспецифічні позитивні результати. Наявність позитивних результатів стандартних серологічних реакцій у осіб без клінічних і анамнестичних ознак сифілісу є головним показником до постановки реакції іммобілізації блідих трепонем. У осіб, вільних від сифілитичної інфекції, результати реакції іммобілізації блідих трепонем будуть негативними, тобто у сироватці таких осіб бліді трепонеми залишаються рухливими. Реакція іммобілізації блідих трепонем є цінним методом для розпізнавання хибнопозитивних реакцій, особливо у вагітних і соматичних хворих. Діагноз прихованого і невідомого сифілісу у таких осіб вимагає обов'язкового підтвердження результатами реакції іммобілізації блідих трепонем і реакції імунофлуоресценції (РІФ). Реакцію іммобілізації блідих трепонем застосовують також для підтвердження діагнозу пізніх форм сифілітичної інфекції.

Відомо, що іммобілізини з'являються у сироватці пізніше антиліпідних і флуоресціюючих антитіл. Тому для ранньої діагностики первинного сифілісу реакція іммобілізації блідих трепонем непридатна. Коли є підозра на первинний сифіліс, найбільш діагностичне цінною є реакція імунофлуоресценції.

МЕЛАНЖЕРНИЙ МЕТОД Н.М.ОВЧИННИКОВА РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ

ПРИНЦИП. Реакція основана на феномені втрати рухливості блідими трепонемами у присутності іммобілізинів досліджуваної сироватки і комплементу. Анаеробні умови досліду створюються переміщенням реагуючої суміші в меланжер (лейкоцетарний змішувач), обидва кінці якого вкриті гумовим кільцем. Меланжерна методика реакції дозволяє обходитись без складного обладнання та апаратури. При порівняльному вивченні на великому клінічному матеріалі одержано результати, які не поступаються класичній анаеростатній методиці.

ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

Постановці основного досліду передбачає підготовча робота, яка складається з таких етапів:

1. Одержання і обробка досліджувані сироватки. Проводиться так само, як і для мікроанаеростатної методики.

2. Приготування середовища для блідих трепонем. Меланжерна методика реакції виконується з тим само середовищем що й мікроанеростатна.

3. Комплемент. Готується і зберігається так само, як і при мікроанаеростатній методиці.

4. Антиген. Застосовується той самий штам блідої трепонеми і методика його приготування така ж, як і для мікроанаеростатної методики.

5. Приготування суміші антигена з комплементом "коктейлю". Попередньо в двох стерильних флаконах або колбах з'єднуються комплемент з антигеном, взятих у рівних об'ємах. Кількість комплементу і антигена залежить від загальної кількості досліджуваних сироваток. На одну сироватку витрачають 0,15 мл комплементу і стільки і антигену. Антиген розливають рівними частинами в два стерильні флакони і додають до одного флакону активний комплемент, а до другого - інактивовану сироватку морської свинки.

6. Гемолітичну сироватку розводять так само, як для мікроанаеростатного методу.

7. Приготування солевого розчину. Розчиняють 9.0 г хлористого натрію хімічно чистого в 1-ому літрі дистильованої води. Розчин фільтрують через паперовий Фільтр і стерилізують автоклавуванням протягом 30 хв. при 2 атмосферах.

Розрахунок кількості інгредіентів для постановки реакції іммобілізації блідих трепонем меланжерним методом.

8. Весь лабораторний посуд промивають і стерилізують так само, як при постановці мікроанаеростатного методу. Меланжери промивають (у рукавичках) за допомогою груші, засмоктуючи в меланжер і вилучаючи з нього дистильовану воду двічі. Промивання послідовне у трьох банках. Потім меланжери складають у стерилізатор і кип'ятять протягом 30 хвилин. Воду зливають, а меланжери переносять у сушильну шафу. Після висушування складають у картонну коробку, загортують у папір і автоклавують так само, як і інший скляний посуд. Після стерилізації знову висушують у сушильній шафі і зберігають у шафі в боксі разом з іншим посудом не більше 7 днів.

ОСНОВНИЙ ДОСЛІД

Кожну сироватку досліджують у двох меланжерах. У перший меланжер набирають досліджувану сироватку до помітки "I". З кінця меланжера стерильним ватним тампоном знімають залишки сироватки. Після цього до помітки "II" набирають "коктейль" з першого флакону. У другий меланжер набирають до помітки "I" ту саму сироватку, а до помітки "II" - "коктейль" з другого флакону. Після надягання кільця вміст меланжерів змішують, меланжери мітять і укладають у спеціальний штатив або коробку з вирізами, штативи вміщують у термостат на 18-20 годин.

При постановці меланжерного методу застосовують ті ж самі контрольні дослідження, які використовують при мікроанаеростатному методі.

ОЦІНКА ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

Через 18-20 годин меланжери виймають з термостату попарно дослідний і контрольний, і вміст їх переносять у наперед підготовлені і пронумеровані відповідно номерам меланжерів пробірки. Для цього після зняття кільця з поміткою меланжер опускають у відповідну пробірку. Вміст меланжера або вільно стікає на дно пробірки, або виштовхується з нього за допомогою гумової піпетки, натягнутої на верхній кінець меланжера. За допомогою цієї піпетки змішують у пробірці рідину і, не знімаючи піпетки з верхнього кінця меланжера, нижнім його кінцем наносять краплю рідини з дослідного меланжера на лівий бік предметного скла, а на правий бік - краплю рідини з контрольного меланжера. Скло попередньо нумерують відповідно до нумерації дослідних меланжерів. Краплі накривають покривним склом, розміром 20 х 20 мм. Реєстрацію результатів і визначення залишкового комплементу проводять так само, як і при мікроанаеростатному методі.

Джерела помилок ті самі, що і під час застосування мікроанаеростатної методики реакції іммобілізації блідих трепонем.

РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ - РІФ (РІФ-АБС І РІФ-200) ДЛЯ СПЕЦИФІЧНОЇ СЕРОДІАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

В останнє десятиліття велике значення для серодіагностики прихованного сифілісу і розпізнавання неспецифічних результатів стандартних результатів серологічних реакцій на сифіліс набрали специфічні реакції, зокрема реакція імунофлуоресценції-РІФ (РІФ-10, РІФ-200, РІФ-АБС). Перевагою РІФ є її більш висока чутливість, що дозволяє використати цю модифікацію реакції для діагностики всіх форм сифілісу, особливо розпізнавання ранніх форм. За специфікою РІФ-АБС і РІФ-200 близькі до реакції іммобілізації блідих трепонем. РІФ-200 і РІФ-АБС ставляться одномоментно з однією порцією крові. РІФ-10 - при підозрі на первинний серонегативний, уроджений, пізні форми сифілісу, під час встановлення ретроспективне діагнозу сифілісу, після лікування.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ

1. Досліджування сироватка крові.

Кров для одержання сироватки беруть з ліктьової вени, шкіру над якою обробляють ефіром, в чисту і суху пробірку в об'ємі 10 мл і обробляють так само, як для постановки реакції Вассермана. Інактивують сироватки крові одноразово при температурі 56 град. С. У зв'язку з тим, що РІФ ставиться не стерильно, використання стерильного посуду і дотримання умов стерильності при зберіганні сироваток не обов'язкове. Воно має значення лише для більш тривалого зберігання сироваток крові до дослідження.

Як антиген використовують завись патогенних блідих трепонем штаму Нікольса 7-добового орхіту кролика. Здорових кроликів-самців з негативними результатами реакції Вассермана і РІТ заражають інтратестикулярно 0,75 - 1,0 мл зависі, густота якої відповідає 40-60 трепонемам у темному полі зору. На 7 добу після зараження кроликів знекровлюють, забивають повітряною емболією і вилучають у них обидва яєчка. Яєчка очищають від жиру, від оболонок, придатків, розрізують на 10-15 кусочків, заливають у колбі 5-10-15 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (РН-7,2 - 7,4) і струшують 50-60 хв. Одержану завись блідих трепонем зливають з кусочків яєчок у стерильні пробірки з ватними пробками і залишають у холодильнику при 4-8 град. С на добу, після чого відокремлюють від осаду і при тих самих умовах зберігають весь період використання.

Одержання і зберігання антигену вимагає дотримання умов стерильності, оскільки з одним і тим самим антигеном реакція може ставитися протягом 2-4 місяців. Для антигена слід вибирати ту завись, в якій не спостерігається аглютинації трепонем і є достатня їх кількість. Антиген може бути одержаний в ампулах з інших лабораторій. Перед кожною постановою реакції завись добре перемішують і досліджують у темному полі зору для визначення її густоти.

При вживанні сухого трепонемного антигена - в ампулу з сухим антигеном добавляють 0,5 мл або 1,0 мл фосфатного буферу (РН 7,2-7,4) і розчиняють 15-20 хвилин. Використовують також, як і нативний антиген.

3. РІФ-АБС. Сорбент.

Як сорбент для РІФ-АБС може бути використаний ультразвуковий трепонемний антиген для РЗК, який випускає Каунаське підприємство по виробництву бактерійних препаратів Міністерства охорони здоров'я Литви. Він є сонікатом, оскільки являє собою розріджену ультразвуком завись суміші культуральних блідих трепонем V, VII, VIII, IX і Рейтера штамів.

Кожна серія сорбенту перед використанням у РІФ-АБС з діагностичною метою має бути відтитрованою.

ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТІВ

Сорбенти титрують на сироватках крові хворих на сифіліс, які дають у РІФ позитивний (4+, 3+), слабопозитивний (2+) результат у розведенні 1:5, на сироватках крові, які дають у РІФ-5 неспецифічну позитивність (2+ і більше), а також на сироватках крові вільних від сифілітичної інфекції.

ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ СОРБЕНТУ

Нерозведений сорбент розчиняють фосфатним буфером (РН 7,2-7,4) в 2,3,4, рази і більше. Беруть три сироватки крові хворих на сифіліс, одна з яких дає в РІФ позитивний (4+) результат, 2-слабопозитивний (2+) результат і 5 сироваток крові від людей, вільних від сифілітичної інфекції, які в тому числі які дають неспецифічні результати (2+ і більше). Сироватки крові розводять сорбентом, розведеденим у 2, 3, 4 - і більше разів і випробовують у РІФ. Контролем у даному досліді є ті самі сироватки крові, розведені у 5 разів не сорбентом, а фосфатним буфером.

Титром сорбенту в даному випадку було розведення 1:3, під час якого всі сироватки крові хворих на сифіліс зберігали ступінь позитивності, одержаний у контролі, і в той же час надійно знімалась неспецифічна позитивність несифілітичних сироваток крові.

РЕЗУЛЬТАТИ ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТУ

4. Антивидова люмінесціююча сироватка

Для дослідження у РІФ-АБС сироваток крові людей необхідна мічена флуорохромом сироватка крові тварин, імунізованих сироватковим білком людини. Люмінесціюючу імунну сироватку проти глобулінів людини випускає Інститут епідеміології і мікробіології АМН Росії ім. М.Ф.Гамалії. Ліофільно висушену люмінесціюючу сироватку розчиняють, дотримуючись умов стерильності, у дистильованій воді в тому об'ємі, який вказано на етикетці ампул, переливають у стерильну пробірку з гумовою пробкою і в процесі використання зберігають при 4 град. С. У день постановки реакції потрібну кількість цієї сироватки розводять за титром дистильованою водою. Вказане на етикетці робоче розведення сироватки не годиться для постановки реакції з метою серодіагностики сифілісу, тому титр кожні серії необхідно визначати заново.

ТИТРУВАННЯ АНТИВИДОВОЇ ЛЮМІНЕСЦІЮЮЧОЇ СИРОВАТКИ

Беруть 5 сироваток крові хворих на сифіліс і 5 сироваток крові здорових людей, розводять їх у 5 разів сорбентом (з врахуванням його титру) і ставлять реакцію з використанням в другій фазі різних розведень люмінесціюючої сироватки проти сироваткових глобулінів людини тієї серії, титр якої визначається. Слід врахувати, що титр люмінесціюючих сироваток, які випускає зараз ІЕМ ім. М.Ф.Гамалії, коливається при постановці РІФ-АБС від 1:100 до 1:140. Враховуючи реакції попереднім титром люмінесціюючої сироватки, слід вважати те розведення, при використанні якого з позитивними сироватками крові одержано краще світіння трепонем, а з негативним світіння антигену не одержано. Більш розведені люмінесціюючі сироватки, ніж титр, приводить до зниження чутливості реакції, а менше - до зниження специфічності. Після визначення попереднього титру слід його уточнити на більшій кількості позитивних і негативних сироваток крові. Остаточним титром можна вважати той, який перевірений на 100 сироватках крові, до того ж, з них не менше 20 має бути від хворих на сифіліс.

Для запобігання проросту після розведення сухої люмінесціюючої сироватки дистильованою водою до неї необхідно добавити мертіолат з розрахунку 1 об'єм його розчину 1:1000 до 9 об'ємів люмінесціюючої сироватки. Під час взяття нових ампул тієї самої серії титр слід лише перевірити і уточнити на 10 явно позитивних і негативних сироватках крові.

ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ПОПЕРЕНЬОГО ТИТРУ ЛЮМІНЕСЦІЮЮЧОЇ АНТИВИДОВОЇ СИРОВАТКИ

Готують 60 препаратів, нумерують їх від 1 до 60. Беруть 10 сироваток крові - 5 від хворих на сифіліс, 5 від здорових людей. Всі сироватки крові розводять у 5 разів розведеним за титром сорбентом. На 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препарати наносять у 1 фазі реакції одні й ті ж 10 сироваток крові, розведених у 5 разів сорбентом. У 2-й фазі реакції на 1-10 препарати наносять люмінесціюючу сироватку, розведену 1:100, на 11-20 - 1:100, на 21-30 - 1:120, на 31-40 - 1:130, на 41-50 - 1:140, на 51-60 - 1:150. Оптимальним слід вважати розведення, при якому світіння антигена буде хорошим при постановці реакції з позитивними сироватками крові і не буде спостерігатися з негативними.

II. ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-АВС

З антигена готують препарати на тонкому, добре знежиреному предметному склі, на зворотному боці яких склорізом позначені кружечки діаметром 0,7 см по 10 кружечків на 1 предметному склі). У межах кружечка на скло наносять антиген - завись блідих трепонем. Запаяним кінцем пастерівської піпетки круговими рухами завись розподіляють у межах кружечка, висушують на повітрі і фіксують над полум'ям спиртівки, 10 хвилин у хімічно чистому ацетоні. Потім препарати нумерують восковим олівцем. Інактивовані досліджувані сироватки крові розводять у 5 разів сорбентом, розведеним за титром буферним розчином. У штативі вміщують ряд пробірок, кількість і номер яких відповідає кількості і номеру досліджуваних сироваток крові. У пробірки піпеткою розливають сорбент по 0,2 мл, потім додають по 0,05 мл досліджуваної сироватки крові і добре перемішують. Розведення сироватки крові можна здійснювати апаратом Флоринського. Розведені сироватки крові наносять на антиген так, щоб рівномірно покрити мазок, і препарати вміщують у вологу камеру, яку закривають кришкою і ставлять на 30 хвилин у термостат при температурі 37 град. С (I фаза реакції). Після I фази препарати обережно промивають у 2 порціях фосфатного буферу, причому у другу порцій препарати вміщують на 10 хвилин після чого їх висушують, знову вміщують у вологу камеру, наносять розведену за титром люмінесцентну сироватку і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин (II фаза реакції). Після закінчення II фази препарати промивають фосфатним буфером, як описано вище, висушують і наносять на поверхню мазків по краплі нелюмінесціюючого імерсійного масла (диметилфталату).

Дослідження препаратів проводять у люмінесцентному мікроскопі з ртутно-кварцевою лампою ДРШ-250, з імерсійною системою, окуляром 4 або 5, фільтрами СЕС-7 або 14, ФС-1, БС-8 і ЖС-18 або Т-2Н. Облік реакції здійснюють шляхом оцінки світіння блідих трепонем. Позитивними в РІФ - АБС вважають сироватки крові, які дають світіння 2+ і більше, негативними - які дають світіння на 1+ або не дають його.

В кожній постановці РІФ - АБС необхідно використати такі види контролю:

Позитивний контроль. Сироватка крові хворого на сифіліс, яка дає виражену флуоресценцію (4+) при розведені буфером у 5 разів. При розведенні у 5 разів сорбентом сироватка крові не повинна втрачати ступінь позитивності більш ніж на 1+.

Слабопозитивний контроль. Ціла або розведена сироватка крові хворого на сифіліс, яка дає слабку ступінь світіння антигена (2+) при розведенні буфером у 5 разів. При розведенні сорбентом позитивність її повинна зберігатися.

Неспецифічний контроль. Несифілітична сироватка крові, яка дає при розведенні буфером флуоресценцію не менше 2+. При розведені сорбентом позитивність повинна бути ліквідована.

Контроль антигена, сорбента, люмінесціюючої сироватки може ставитися лише при використанні нових серій цих інгредієнтів.

III. ПОСТАНОВКА РІФ - АБС 3 КРОВ'Ю, ВЗЯТОЮ З ПАЛЬЦЯ

Постановка РІФ - АБС можлива не лише з сироваткою крові, але і кров'ю, взятою з пальця. Цю модифікацію РІФ-АБС можна використати при обстеженні на сифіліс дітей, при труднощах одержання крові з вени у дорослих, при масовому обстеженні різних контингентів на сифіліс.

При постановці РІФ-АБС застосовують ті самі інгредієнти реакції, що й при постановці РІФ-АБС - з сироваткою крові (антиген, сорбент, люмінесціююча сироватка). Проте титр люмінесціюючої сироватки визначають за вищевикладеною схемою, але при постановці реакції з кров'ю, а не сироваткою крові. Кров для дослідження після проколу пальця пацієнта голкою набирають мікропіпеткою до помітки 0,1 мл, швидко видувають у пробірку, що містить 0,3 мл дистильованої води, старанно перемішують піпеткою, фільтрують через паперовий фільтр, змочений дистильованою водою.

Постановка реакції з розведеною кров'ю можлива як у день взяття її, так і через 1-2 дні при умові зберігання при 4 град. С.

Безпосередньо перед постановкою реакції до всіх зразків крові, включених в постановку реакції, добавляють по 0,1 мл цільного сорбенту, переміщують піпеткою і струшують, вміщують на 30 хв. у термостат при 37 град. С. Потім кров, оброблену сорбентом, наносять на мазки антигена і вміщують у вологу камеру при 37 град. С (I фаза реакції). Після закінчення строку експозиції кров промивають у першій порції фосфатного буферу так. щоб на склі не залишилося слідів крові і вміщують препарати на 10 хв. у другу порцію буфера. Після висушування препаратів проводять II фазу реакції. При цьому на препарати наносять розведену за титром, установленому для даної модифікації РІФ, люмінесціюючу сироватку проти глобулінів людини. Скло у вологій камері знову вміщують у термостат при 37 град. С.

Через 30 хв. препарати знову промивають у 2 порціях фосфатного буферу протягом 10 хв., висушують і монтують для люмінесцентної мікроскопії. Дослідження препаратів і облік результатів реакції проводять так само, як і при постановці РІФ-АБС з сироваткою крові.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ-200

Методика постановки РІФ-АБС і РІФ - 200 близькі. При постановці РІФ - 200 обробка досліджуваних сироваток крові, приготування антигена, підготовка антивидової люмінесціючої сироватки та її титрування проводяться так само, як і при підготовці РІФ-АБС. Слід врахувати тільки, що титри люмінесціюючої сироватки, яку випускають зараз, у РІФ-200 коливаються від 1:10 до 1:50.

ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-200

Досліджувані сироватки крові розводять у 200 разів фосфатним буфером. Для цього в штатив вміщують 3 ряди пробірок, число і нумерація яких у кожному ряду відповідає кількості і нумерації досліджуваних сироваток крові у робочому журналі. У першому ряду налито нерозведені досліджувані сироватки крові, у другому ряду у пробірку наливають по 0,45 мл буфера, у третьому - по 0,95 мл буфера. У другому ряду готують розведення сироваток крові в 10 разів, для чого з кожної пробірки першого ряду окремою 1 мл градуйованою піпеткою беруть 0,05 мл досліджуваної сироватки крові, переносять у відповідну пробірку другого ряду і змішують з буфером, що там є. З кожної пробірки другого ряду тією самою піпеткою переносять по 0,05 мл розведеної уже в 10 разів досліджуваної сироватки крові у відповідну пробірку третього ряду і одержують розведення в 200 разів.

Для проведення I фази на вміщені у вологу камеру препарати наносять розведені в 200 разів досліджуваної сироватки крові так, щоб їх номери, позначені на пробірках, відповідали номерам на предметних скельцях. Після нанесення на препарати сироватки крові вологу камеру вміщують на 30 хв. у термостат з температурою 37 град. С (I фаза реакції). Потім препарати промивають 10 хвилин у 2 порціях буфера і висушують. Після цього препарати знову вміщують у вологу камеру 1 на все наносять розведену за титром люмінесціюючу сироватку (II фаза реакції). Другу фазу проводять 30 хв. при кімнатній температурі. Після чого препарати 10 хв. промивають, висушують і монтують для люмінесцентної мікроскопії. Облік результатів РІФ - 200 проводять так само, як РІФ-АБС. У тому випадку, коли клініцистів цікавить титр флуоресціюючих антитіл у сироватці крові хворого, РІФ-АБС і РІФ - 200 слід ставити з послідовним розведенням досліджуваних сироваток крові, яке ще дає слабопозитивний результат реакції (2+). Позначати титр прийнято числом, що характеризує ступінь розведення досліджуваної сироватки крові, наприклад: 5, 10, 20, 40 і т.д. (РІФ - АБС або 200, 400, 800 і т.д. (РІФ-200).

При постановці обох модифікацій реакції для розведення досліджуваних сироваток крові і для промивання препаратів після I і II фази слід використати фосфатний буфер такого складу: 1 л дистильованої води, 6,8 г хлористого натрію, 1,48 г двозаміщеного фосфорнокислого натрію, 0.43 г однозаміщеного фосфорнокислого калію (РН = 7,2).

У зв'язку з можливою негативацією результатів реакції не варто досліджувати кров і сироватку крові в РІФ-АБС і РІФ-200 під час лікування хворих пеніциліном.

РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ (РІФ-Ц) І РІФ-10 ДЛЯ ЛІКВОРДІВАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

Рання діагностика уражень нервової системи при сифілісі є актуальним питанням у справі боротьби з цим захворюванням. У зв'язку з тим, що РІФ-Ц має більшу чутливість, ніж всі інші тести, які використовують для ліквордіагностики сифілісу, ця модифікація РІФ може бути рекомендована для діагностики сифілітичних уражень центральної нервової системи при всіх формах сифілісу.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ-Ц

Для постановки РІФ-Ц використовують той самий антиген, люмінесціюючу сироватку, що і для постановки РІФ-АБС і РІФ-200 з сироваткою крові. Аналогічні також визначення флюоресціуючих антитіл у лікворі і сироватці крові і облік реакції.

Спиномозкова рідина вводиться у реакцію неінактивованою і нерозведеною. До постановки реакції її зберігають у морозильному відділені холодильника у пробірках під гумовими пробками. Відтанення проводять при кімнатній температурі.

ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-Ц

9 1-й фазі реакції на антиген наносять 0,05 мл нерозведеної досліджуваної спинномозкової рідини, препарати вміщують у вологу камеру на 30 хв. при кімнатній температурі. Потім їх промивають фосфатним буфером, РН=7,2-7,4 протягом 10 хв., висушують. У II фазі на препарати наносять розведену за титром люмінесціюючу сироватку, яку титрують при постановці реакції з спинномозковою рідиною. Витримують препарати при кімнатній температурі 30 хв. у вологій камері, промивають, висушують, монтують для люмінесцентної мікроскопії.

ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ (ІФА)

Принцип непрямої методики ІФА при використанні пластин з лунками.

До поверхні носія, відштампованого у вигляді пластин з лунками, приєднується антиген, який міцно на ній фіксується.

I фаза. Заповнення лунок пластин досліджуваної сироваткою. (При наявності протитрепонемних антитіл утворюється комплекс антиген-антитіло).

II фаза. Заповненя лунок пластин кон'югатами, що містять противидові антитіла, пов'язані з ферментом. Кон'югат міцно приєднується до комплексу антиген-антитіло.

III фаза. Заповнення лунок пластин субстратною сумішшю, складеною з речовин, які в присутності ферменту змінюють забарвлення (коричневе, світлокоричневе). Рахують візуально або при використанні фотометру.

ІФА-ЕТАП

1. Сенсабілізація лунок плати антигеном, інкубація 18 годин у темному місці при кімнатній температурі (по 0,2 мл в кожну лунку).

2. Промивання лунок плати фіз. розчином з ТВ-20.

3. Розведення досліджуваних і контрольних сироваток. Інкубація 60 хв. при 37 град. С (0,2 мл). Сорбція.

4. Нанесення розведених сироваток у лунки плати. Інкубація 30 хв. при температурі 37 град. С (по 0,2 мл). Вилучати струшуванням.

5. Промивання лунок плати 3 рази фіз. розчином з ТВ-20.

6. Розведення кон'югата (антивидові антитіла).

7. Нанесення кон'югата в лунки плати. Інкубація 30 хв. при температурі 37 град. С (по 0,2 мл) у кожну лунку, крім 1-го контролю).

8. Промивання лунок плати 3 рази фіз. розчином з ТВ-20.

9. Приготування розчину субстрату.

ПІДГОТОВКА ДО ДОСЛІДУ

1. Приготувати карбонатно-бікарбонатний буфер 0,1 мл (РН = 9,6 + 0,1).

Зберігається у холодильнику 1-н тиждень.

3. Для промивання планшетів у фіз. розчині перед використанням добавляють ТВ-20 (на 1 літр фіз. розчину 0,5 мл ТВ-20).

4. Антиген для нанесення на плати:

вміст флакону розводять фіз. розчином без ТВ-20 (в 5 мл).

5. Робочий розчин ультраозвученого антигена готують, використовуючи карбонатно-бікарбонатний буфер, у розведенні, вказаному на етикетці.

Якщо титр 1:40, то 0,25 мл розчину антигена + 9,75 мл буфера. Вихідний антиген, що залишився, зберігати (-18 +- 2 град. С. На 1 плату потрібно 20 мл робочого розчину, на 4 плати - 80 мл. 2 мл вихідного антигена + 78 мл буферного розчину. 2,5 мл вихідного антигена + 97,5 мл буферного розчину з запасом). Промити планшети фіз. розчином без детергента - 3 рази.

6. Наливати по 0,2 мл антигена в кожну лунку плати, закрити кришкою і помістити у темне місце при кімнатній температурі на 18 годин.

7. Промивання лунок плати:

різким рухом виділити вміст лунок плати. Плату заливають приготовленим розчином (фіз. розчин + ТВ-20).

Різким рухом виділяють знову залитий фіз. розчин + ТВ-20 (всього три рази).

Потім плати тричі за 5 хвилин заливають фіз. розчином з ТВ-20 після останнього виділення розчину, вилучають рештки ударом об фільтрувальний папір.

8. Розведення контрольних і досліджуваних сироваток.

Контрольні позитивні і негативні сироватки розводять у 0,5 мл стерильної дистильованої води для ін'єкцій.

Сорбент розчиняють, вміст флакону з етикеткою "Пептон ферментативний сухий" розчиняють в 150 мл дистильованої води. До 150 мл розчину додають вміст флакону з етикеткою "Препарат сироватки молока, сухий" і 0,75 мл твина (детергента). Старанно перемішують. Розчин готують перед використанням і не зберігають. Цієї кількості вистачає на 1-у плату.

1-й ряд 0,45 мл сорбента + 0,05 мл сироватки, розведеної 1:10;

2-й ряд 1,9 мл сорбента + 0,1 мл сироватки, розведеної 1:200.

Слабопозитивну сироватку роблять з позитивної сироватки з розведення 1:10, взявши 0,02 мл сироватки + 1,98 сорбента (1:1000).

Інкубація у термостаті 60 хв. при температурі 37 град. С.

I ФАЗА

Нанесення сироваток на плату:

Після інкубації з сорбентом сироватки наносять по 0,2 мл (2 лунки на одну сироватку).

В останні 8 лунок вносять контролі:

I - фіз. розчин контроль субстрата.

VI - негативна сироватка, контроль негативної сироватки.

Накрити кришкою і помістити у термостат на 30 хв. при температурі 37 град. С.

Виділити струшуванням і відмити тричі по 5 хв.

II ФАЗА

Розводять як вказано на ампулі (0,5 мл стерильної дистильованої води) або в 5 мл розведення 1:10.

Робоче розведення: на розчині, що містить 50 % сорбента і 50% фіз.розчину з ТВ-20.

0,7 мл кон'югата + 10,15 мл сорбента + 10,15 мл фіз.розчину з ТВ-20.

Нерозведений кон'югат, що залишився, зберігають при температурі 18 +- 2 град. С один місяц (розлитий по 1-у мл). У кожну лунку планшета вносять по 0,2 мл кон'югата в робочому розведенні, а в контролі в 1 місце вносять фіз.розчин замість кон'югата; планшет витримують у термостаті при температурі 37 град. С 30 хв.

Вилучають рідину з лунок планшета струшуванням і відмивають тричі фіз. розчином з ТВ-20 і три рази по 5 хв.

Після останнього виведення розчину усувають рештки його ударом об фільтрувальний папір.

III ФАЗА ПРИГОТУВАННЯ СУБСТРАТУ

Готують за 30 хв. до використання 20 мг - 5-аміносаліцилової кислоти + 25 мл Н О,

На рН-метрі доводять до рН 6,0 +-0,05 розчином 0,1 NaOH (зберігають у темному місці при температурі 20+-2 град. С).

Потім до 9 частин кислоти + 1 частина 0,05 % Н О.

1. 8,75 мл дист. Н О + 0,25 мл 355 Н О.

4. Змішують.

До кожної лунки планшету вносять піпеткою по 0,2 мл субстратної суміші в усі лунки з досліджуваними сироватками і контролями (I-VI). Планшети витримують 60 хв. при температурі (20 +- 2 град. С) у захищеному від світла місці.

У лунках планшету, де пройшла реакція, з'являється забарвлення від світлокоричневого до темнокоричневого. В лунках, де проводилися дослідження негативної сироватки, колір субстрату світло- або темно-бежевий.

Спочатку субстрат вносять у I контроль і II контроль, якщо через 5 хв. немає коричневого кольору, уточняють і готують субстрат знову і заливають у П , а потім всі інші.

VI - прозоре або світло-жовте забарвлення.

ПРАВИЛА РОБОТИ У СЕРОЛОГІЧНИХ ЛАБОРАТОРІЯХ

Впорядкування і вміст приміщень.

Лабораторія має бути забезпечена водопроводом, гарячим водопостачанням, каналізацією, центральним водяним опаленням і газом (якщо в населеному пункті є газова мережа). В населених пунктах, де немає водопроводу та каналізації, бажано обладнати місцевій водопровід, каналізацію і очисні споруди.

У виробничих приміщеннях лабораторій мають бути обладнані дві водопровідні раковини, одна - для миття рук персоналу, друга - для миття лабораторного інвентарю і посуду.

АПАРАТИ, ПРИЛАДИ, УСТАТКУВАННЯ

Електроприлади: центрифуги, сушильні шафи, термостати, водяні бані, автоклав необхідно заземлити.

Під час роботи з мікроскопом слід забезпечити правильне освітлення поля зору. Під час роботи з мікроскопом рекомендовано використовувати бінокуляр, якщо його немає, то не закривати око, що не працює, працювати поперемінно то одним, то іншим оком, робити перерви у роботі при перевтомленні зору.

Під час роботи з обертальними пристроями дотримуватися правил, що гарантують безпеку обслуговуючому персоналу, а саме:

центрифугу включати лише після закриття кришки;

пробірки виймаються лише після закриття кришки;

волосся працівника має бути підібране під косинку або шапочку.

РОБОТИ З ІНФІКОВАНИМ МАТЕРІАЛОМ

Для одержання інфекційного матеріалу від тварин має бути спеціальний стіл з набором інструментів, які використовують лише для цих цілей.

Бокси, в яких проводиться робота з блідими трепонемами, повинні мати таке устаткування:

шафа для посуду та інструментів;

стіл, покритий лінолеумом або нержавіючим залізом;

банки з дизрочином;

емальований посуд з кришками для використаного інфікованого посуду і відпрацьованого матеріалу;

бактерицидні лампи для стерилізації повітря і устаткування.

За межі даної установи інфікований матеріал виносять у пробірках, флаконах і ін., загорнутих в гігроскопічну вату і вміщених у металеву посудину, яка щільно закривається кришкою.

Бокси, в яких проводиться робота з зараженими тваринами, повинні мати таке обладнання;

шафа для посуду, інструменти;

стіл, покритий лінолеумом;

дерев'яні станки для фіксації тварин, які повинні бути пофарбовані світлою масляною або нітрофарбою;

бактерицидна лампа.

Оперативні втручання на заражених тваринах і зараження повинні проводитися у фартухах, гумових рукавичках і захисних окулярах. Після роботи фартух і рукавички; обробляють дезінфікованим розчином, рукавички кип'ятять протягом 30 хвилин.

Тушки убитих тварин, хворих на сифіліс, необхідно збирати у спеціальне сховище з наступним спалюванням. При неможливості спалювання, тушки заливають 5 % розчином хлораміну на добу, а потім закопують у землю далеко від житлових приміщень на достатню глибину (0.7-1 метр), не допускаючи викопування їх іншими тваринами (собаками, кішками та ін.).

У процесі роботи і після її закінчення застосовують такі способи дезинфекції. Посуд, що стикається з блідими трепонемами або містить заражені шматочки тканин, занурюють у воду з миючими засобами типу "Лотос" кімнатної температури без застосування дезінфікуючих засобів, кип'ятять протягом 30 хв. у вказаному розчині, охолоджують і миють проточною водопровідною, спочатку теплою, потім, холодною водою, з наступним прополіскуванням дистильованою водою.

Отвір верхнього кінця, за допомогою якого насмоктують інфікований матеріал, повинен бути щільно закритий ватним тампоном.

Піпетки, забруднені блідими трепонемами вміщують у 3-5% розчин карболової кислоти на 1-у годину, потім промивають 5-6 разів водопровідною водою і один раз дистильованою. Якщо піпетки при цьому не стають прозорими, їх занурюють у розчин хромової суміші на добу, після чого промивають 9 разів водопровідною водою і один раз - дистильованою.

Кров, що поступила на дослідження, і одержану з неї сироватку після роботи зливають у каналізацію, попередньо обробивши дезінфікованим засобом.

Посуд після використання промивають під проточною водою, потім замочують гарячим (50 град. С) миючим засобом на 30 хв., повністю зануривши його у розчин і заповнивши порожнини.

Потім посуд миють йоржами або ватно-марлевими тампонами, в середньому 25-30 секунд один предмет. Вимитий посуд споліскують у проточній воді, потім у дистильованій воді і висушують при температурі 180-200 град. С протягом 45 хвилин.

Як миючий розчин застосовують 0,5% комплекс перекису водню з миючими засобами - "новость", "прогрес", сульфанол, триалотос, "астра" тощо.

Мокрі пробірки складають у спеціальні ящики, на дні яких є отвори, через які стікає вода, яка залишилася після миття у пробірках. При великій кількості пробірок мити їх зручно за допомогою пристрою до водопровідного крану, а також йоржами, запропоновано О.В.Флоринським.

Поверхню робочих столів у кінці кожного робочого дня, а також при забруднені їх кров'ю, сироваткою крові обробляють дезінфікуючим розчином (80 мл 96 град. спирту + 20 мл дистильованої води + 7 мл 33% пергідролю, розчином сулеми 1:1.000 та ін.).

У випадку забруднення рук кров'ю слід вимити їх теплою водою з господарським милом, насухо витерти і обробити тампоном, змоченим антисептиком (6% розчину перекису водню або 0,1% розчину девоксану та ін.) або вказаним вище дезинфікуючим розчином (80 мл 96 град. спирту і 20 мл дистильованої води + 7 мл 33% пергідролю).

Всі маніпуляції, при яких може статися забруднення рук кров'ю і сироваткою крові, слід проводити у гумових рукавичках.

Під час роботи з кров'ю, сироваткою крові треба користуватися гумовою грушею. Засмоктування ротом не допускається.

ЗАХОДИ НА ВИПАДОК АВАРІЇ

При аварії під час роботи з інфекційним матеріалом (биття посуду, розбризкування з шприця при зараженні тварин, а також у всіх випадках, що ведуть до забруднення заразним матеріалом оточуючих предметів, одягу і відкритих частин тіла працівників) присутній при цьому персонал зобов'язаний негайно повідомити про те, що сталося, завідуючого лабораторією і провести знезаражування приміщення, обладнання і предметів, які могли бути інфікованими, а також провести самознезаражування.

Для ліквідації наслідків аварії використовують такі методи обеззаражування:

горизонтальну поверхню, на яку попав заразний матеріал, заливають дезінфікуючим розчином (5% розчин хлораміну або 5% розчин карболової кислоти):

вертикальні поверхні (забруднення стін, поверхні меблів, приладів), протирають ватним або марлевим тампоном, добре змоченим дезінфікуючим розчином;

забруднений одяг знімають і замочують у дезінфікуючому розчині;

забруднене взуття обмивають тампоном, змоченим дезрозчином;

відкриті ділянки шкіри лиця, рук і частин тіла у випадку забруднення їх заразними матеріалами (завись блідих трепонем, сироватка з інфекційного відділення) обробляють 70% етиловим спиртом;

при забруднені слизистих оболонок рота прополіскують розчином соди або 0,5% розчином соляної кислоти, очі промивають водою і закапують свіжоприготовленим 1% розчином азотнокислого срібла або 30% альбуциду; у ніс закапують 1-2 краплі 1% розчину проторголу і проводять профілактичне лікування;

під час нещасного випадку, пов'язаного з пораненням або укусом заражених тварин, або іншими порушеннями цілісності шкірного покриву, необхідно видавити з ранки кров, змазати рану 5% настойкою йоду і провести курс профілактичного лікування. При подряпанні шкіри зараженою твариною на місце враження кладуть на 5 хвилин компрес з 5% розчином лізолу або роблять ванночку з того самого розчину.

NN п/п	Назва дослідження	Час на 1-е дос. у хвилинах витрачене
NN п/п	Назва дослідження	лікар.	лаб.
1	2	3	4
1	Дослідження, які проводять обов'язково комплексно при обстеженні на сифіліс донорів, вагітних, гінекологічних, неврологічних і психіатричних хворих, осіб з клінічною і анамнестичною підозрою на сифіліс, під час процесу лікування хворих на сифіліс
1.1.	Реакція зв'язування комплементу (РЗК) з кардіоліпіновим антигеном, якісна методика	0,75	1.5
1.2.	Реакція зв'язування комплементу з трепонемним антигеном, якісна методика	0.75	1,5
1.3.	Реакція зв'язування комплементу з кардіоліпіновим антигеном, кількісна методика - при одержанні позитивних результатів у РЗК якісною	6.0
1.4.	Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з інакти- вованою сироваткою, якісна методика	0,75	1,5
2.	Дослідження, які проводять ізольовано під час обстеження на сифіліс соматичних хворих і осіб, що підлягають періодичним медоглядам на сифіліс
2.1.	Мікрореакція преципітації (МР) з кардіоліпіновим антигеном з інакти- вованою сироваткою, якісна методика	0.75	1,5
2.2.	Мікрореакція преципітації з кардіоліпіновим антигеном з плазмою крові, якісна методика	0.75	1.5
2.3.	Мікрореакція преципітації з кардіоліпіновим антигеном з інактивованою сироваткою або плазмою крові, кількісна методика	6.0
3.	Специфічні дослідження, які проводять обов'язково комплексно для діагностики сифілісу і контролю виліковності
3.1.	Реакція імунофлуоресценції, непрямий метод РІФ-200, якісна методика	7.0	7.0
3.2.	Реакція імунофлуоресценції з абсорбцією, непрямий метод - РІФ - АБС, якісна методика	8.0	7.0
3.3.	Реакція імунофлуоресценції, кількісна методика при одержанні позитивних результатів у РІФ-якісної	15,0	-
4.	Реакція іммобілізації блідих трепонем (РІТ), класичний або меланжерний метод, якісна методика	38.0	37,0
5.	Іммуноферментний аналіз (ІФА), якісна методика	15.0	-
6.	Дослідження спинномозкової рідини
6.1	Реакція зв'язування комплементу з кардіоліпіновим антигеном, якісна методика	0,75	1.5
6.2.	Реакція зв'язування комплементу з трепонемним антигеном, якісна методика	0,25	1.5
6.3.	Реакція імунофлуоресценції з нерозведеною спинномозковою рідиною (РІФ-н), якісна методика	7,0	7,0
6.4.	Реакція імунофлуоресценції з спинномозковою рідиною (РІФ-1020), кількісна методика	8,0	-
7.	Серологічні дослідження, що проводяться за показниками:
7.1.	Реакція імунофлуоресценції, непрямий метод (РІФ-10), якісна методика	7,0	6,0
7.2.	Реакція зв'язування комплементу (РЗК) на холоді з кардіоліпіновим і трепонемним антигенами, якісна методика	1.5	3,0
7.3.	Реакція іммобілізації блідих трепонем зі збільшенням об'єму сироватки, якісна методика	38,0	37.0
8.	Окремі трудові операції з підготовки дослідження, обліку та оформленню результатів для 1 зразка крові (включають в розрахунок річного обсягу роботи РО посади лікаря-лаборанта або лаборанта)
8.1.	Взяття крові з пальця для одержання плазми	-	1.5
8.2.	Обробка зразка венозної або капілярної крові для одержання сироватки або плазми, включаючи прийом та кодування	-	1,5
8.3.	Кодування бланка аналізу і звіряння з супроводжувальною документацією	-
8.4.	Реєстрація кількості досліджень по відділенням і лікпрофустановам	-	0,5
8.5.	Оформлення результатів на бланку аналізу і внесення результатів до картотеки (на 1 обстежуваного)	1,0	0,5

N про- бірки	Гемолізин	Ізотонічний розчин натрію хлориду	Розведення гемолізину
I	0,1 (не розведений)	9,9	1:100
II	0,5 1-го розведення	4,5	1:1000
III	0,5 -"-	5,5	1:1200
IV	0,5 -"-	7,0	1:1500
У	0,5 -"-	8,5	1:1800
VI	0.5 -"-	10,0	1:2100
VII	0,5 -"-	11,5	1:2400
VIII	0,5 -"-	13,0	1:2700
IX	0,5 -"-	14,5	1:3000
Х	0,5 -"-	22,0	1:4000

Інгредієнти/мл	Контрольні пробірки
Інгредієнти/мл	1	2	3	4	5
Гемолітична сироватка розведення по потроєному титру
3 % завись еритроцитів барана з щільного осаду
Комплемент 1:10
Ізотонічний розчин натрію хлориду
Антиген трепонемний, розведений по титру
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру
Ставлять у термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин
Результат
Після 45 хвилин перебування у термостаті при температурі 37 град. С у всіх контрольних пробірках має бути відсутній гемоліз

Інгредієнти (мл) (загальний об'єм 1,25 мл)	NN пробірок
Інгредієнти (мл) (загальний об'єм 1,25 мл)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Комплемент 1:10	0.1	0.16	0.2	0.24	0.3	0.36	0.4	0.44	0.5	0.56	0.6
Ізотонічний розчин натрію хлориду	0.9	0.84	0.8	0.76	0.7	0.64	0.6	0.56	0.5	0.44	0.4
Після старанного змішування з кожної пробірки переносять по 0.25 мл у пробірки другого, третього ряду, що відповідно стоять позад і виливають
Негативна інактивована сироватка крові людини 1:5	по 0.25 в усі 33 пробірки
Антиген трепонемний, розведений по титру	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Антиген трепонемний, розведений по титру				перший ряд пробірок
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру				другий ряд пробірок
Ізотонічний розчин натрію хлориду	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Ізотонічний розчин натрію хлориду				третій ряд пробірок
Гемолітична система	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Гемолітична система	Струсити, помістити в термостат при 37 град. на 45 хв.
Гемолітична система	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Гемолітична система	(перший і другий ряди) Струсити, помістити в термостат при 37 град. на 45 хв.
Результат	-Г	-Г	-Г	-Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г	+Г

ІНГРЕДІЕНТИ	NN пробірок
ІНГРЕДІЕНТИ	1	2	3 (контр.)
1	2	3	4
Досліджувана інактивована сироватка, розведена 1:5	0.25	0.25	0.25
Антиген трепонемний, розведений по титру	0.25	-	-
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру	-	0.25	-
Ізотонічний розчин натрію хлориду	-	-	0.25
Комплемент, розведений за робочою дозою	0.25	0.25	0.25
Струсити, поставити на 45 хвилин у термостат при температурі 37 град. С
Гемолітична система	0.5	0.5	0.5
Струсити, поставити на 45-60 хвилин у термостат при температурі 37 град. С (до настання гемолізу в контрольній пробірці)

N пробі- рок відпо- відно т. N 1	Розведе- ння гемолі- зину	Гемолі- зин у відп. розве- деннях	Ізото- нічний розчин хлори- ду натрію	Компле- мент 10% (мл)	3 % зависі еритроцитів барана з щільного осаду	Резуль- тат
1	1:1000	0,5	1,0	0,5	0,5	Гемоліз
2	1:1200	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
3	1:1500	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
4	1:1800	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
5	1:2100	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
6	1:2400	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
7	1:2700	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
8	1:3000	0,5	1,0	0,5	0,5	-"-
9	1:4000	0,5	1.0	0,5	0,5	-"-
Контролі
10	1:1000	0,5	1,5	-	0,5	Затримка гемолізу
11	1:1000	-	1,5	0,5	0,5	-"-
12	1:1000	-	2,0	-	0,5	-"-

Інгредієнти (в мл)	NN пробірок
Інгредієнти (в мл)	1	2	3	4	5	6	7	8
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Ізотонічний розчин натрію хлориду	0.8	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Досліджувана інактивована сироватка крові	0.2	Після змішування з 1-ї пробірки 0.25 мл вилучають, а 2 і 8 пробірок переносять по 0.25 мл. З другої пробірки після змішування переносять послідовно з пробірки у пробірку (з 2 в 3, з 3 в 4 і т.д. до 7 пробірки включно) по 0.25 мл. Одежують розведення сироватки: 1:5, 1:10 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320.
Антиген, розведений по титру (кардіоліпіновий)	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Комплемент розведений по робочій дозі	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Комплемент розведений по робочій дозі	Струсити, поставити у термостат при температурі 37 град. С на 45 хвилин
Гемолітична система	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Гемолітична система	Струсити, поставити у термостат при температурі 37 град. С до настання повного гемолізу в контрольній пробірці на 30-60 хв.
Результат	4+	4+	4+	3+	-	-	-	-
Результат	У даному випадку титр сироватки 1:40

ІНГРЕДІЄНТИ	NN пробірок
ІНГРЕДІЄНТИ	1	2	3 (контр.)
1	2	3	4
Досліджувана інактивована сироватка крові, розведена 1:5	0.25	0.25	0.25
Антиген трепонемний, розведений по титру	0.25	-	-
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру	-	0.25	0.25
Антиген кардіоліпіновий, розведений по титру	Струсити, витримати 10 хв. при кімнатній температурі
Ізотонічний розчин натрію хлориду	-	-	0.25
Комплемент, розведений з 50 % надбавкою в робочій дозі	0.25	0.25	0.25
Струсити, поставити на 18-20 год. у холодильник при температурі 4 град. С, натупного дня вміст пробірок і гемолітичної системи витримувати при кімнатній температурі 15 хв. з наступною інкубацією в термостаті 37 град. С 15 хв.
Гемолітична система	0.5	0.5	0.5
Струсити, поставити на 45-60 хвилин у термостат при температурі 37 град. С (до настання гемолізу в контрольних сироватках).

(мікроанаеростатна методика)
ІНГРЕДІЕНТИ	NN пробірок
ІНГРЕДІЕНТИ	1 дос- лід- на	2 кон- тро- ль	3	4	5	6	7	8	9
Досліджувана інактивована сироватка	0.05	0.05	-	-	-	-	-	-	-
Комплемент активний	0,15	-	0,15	-	0.15	-	0.15	-	-
Комплемент інактивований	-	0.15	-	0,15	-	0.15	-	0,15	-
Антиген	0.35	0,35	0.35	0,35	0,35	0.35	0,35	0.35	0.35
Позитивна інактивована сироватка	-	-	0.35	0.35	-	-	-	-	-
Негативна інактивована сироватка	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Кількість рухливих трепонем у контр. пробірці	Кількість рухливих трепонем у дослідних пробірках
Кількість рухливих трепонем у контр. пробірці	25	24	23	22	21	20	19	18	17	16	15	14	13	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1	0
25	0	4	8	12	16	20	24	28	32	36	40	44	48	52	56	60	64	68	72	76	80	84	88	92	96	100
24	0	0	4	8	12	17	21	25	29	33	37	42	46	50	54	58	62	67	71	75	79	83	87	92	96	100
23	0	0	0	4	9	13	17	22	26	30	35	39	43	48	52	56	61	65	69	74	78	83	87	94	96	100
22	0	0	0	0	5	9	14	19	23	27	32	36	41	45	50	54	59	63	68	73	77	82	86	91	95	100
21	0	0	0	0	0	5	10	14	19	24	29	33	38	43	48	52	57	62	67	71	76	81	86	90	95	100
20	0	0	0	0	0	0	5	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100
1З	0	0	0	0	0	0	0	5	11	16	21	26	32	37	42	47	53	56	63	68	74	79	84	89	95	100
18	0	0	0	0	0	0	0	0	6	11	17	22	28	35	39	44	50	56	61	67	72	78	83	89	94	100
17	0	0	0	0	0	0	0	0	0	6	12	18	24	28	35	41	47	53	59	65	71	76	82	88	94	100

ІНГРЕДІЕНТИ (В МЛ)	Кількість досліджуванної сироватки
ІНГРЕДІЕНТИ (В МЛ)	1	5	10	20	30
Флакон 1 (дослід) Антиген	0,15	0,75	1,5	3,0	4,5
Активна сироватка морської свинки (комплемент)	0,15	0,75	1,5	3,0	4.5
Флакон 2 (контроль) Антиген	0.15	0,75	1.5	3.0	4.5
Інактивована сироватка морської свинки (комплемент)	0,15	0,75	1.5	3.0	4,5

Досліджувана сироватка крові	Результати РІФ-5
	Розведення сироваток крові 1:5 буфером (К)	Розведення сироваток крові 1:5 сорбентом у розведенні
	Розведення сироваток крові 1:5 буфером (К)	1:2	1:3	1:4
Сироватка крові хворого на сифіліс N 1	4+	3+	4+	4+
N 2	2+	1+	2+	2+
N 3	2+	-	2+	2+
Несифілітична сироватка крові N 1	3+	-	1+	2+
N 2	2/3+	-	-	2+
N 3	2+	-	-	2+
N 4	-	-	-	-
N 5	-	-	-	-

Про організацію лабораторної діагностики сифілісу в Україні

ПОЛОЖЕННЯ ПРО ЦЕНТРАЛІЗОВАНУ СЕРОЛОГІЧНУ ЛАБОРАТОРІЮ

ВИКОРИСТАННЯ РОЗРАХУНКОВИХ НОРМ ЧАСУ НА ДОСЛІДЖЕННЯ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

ІНСТРУКЦІЯ ПРО ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ СЕРОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЬ НА СИФІЛІС

МЕТОДИКА

постановки відбіркових мікрореакцій преципітації

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ МІКРОРЕАКЦІЇ 3 ПЛАЗМОЮ І ІНАКТИВОВАНОЮ СИРОВАТКОЮ КРОВІ

КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД МІКРОРЕАКЦІЇ

КОМПЛЕКС СТАНДАРТНИХ СЕРОЛОГІЧНИХ РЕАКЦІЙ (РЕАКЦІЯ ЗВТЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА)

ГЕМОЛІТИЧНА СИРОВАТКИ (ГЕМОЛІЗИН)

СХЕМИ РОЗВЕДЕНЬ ГЕМОЛІЗИНУ

ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ ГЕМОЛІЗИНУ

ЕРИТРОЦИТИ БАРАНА

КОМПЛЕМЕНТ

СХЕМА ПРОВЕДЕННЯ КОНТРОЛЮ

ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ОБ'ЄМІ 1,25 МЛ

МЕТОДИКА

постановки реакції Вассермана

ТИТРУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ В ПРИСУТНОСТІ АНТИГЕНУ І НЕГАТИВНОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ ЛЮДИНИ

ВИТРАТИ ІНГРЕДІЄНТІВ НА 100 ДОСЛІДЖЕНЬ

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ЯКІСНОЇ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

КІЛЬКІСНИЙ МЕТОД РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

СХЕМА ПОСТАНОВКИ КІЛЬКІСНОГО МЕТОДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА

РЕАКЦІЯ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ

ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ

ДЖЕРЕЛА ПОМИЛОК

РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ

СХЕМИ ДОСЛІДУ РЕАКЦІЇ ВАССЕРМАНА ЗІ СПИННОМОЗКОВОЮ РІДИНОЮ

РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ НА ХОЛОДІ

РЕАКЦІЯ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ (РІТ)

ОБРОБКА ЛАБОРАТОРНОГО ПОСУДУ

ОДЕРЖАННЯ ДОСЛІДЖУВАНОЇ СИРОВАТКИ ТА ЇЇ ОБРОБКА

СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИЖИВАННЯ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

КОМПЛЕМЕНТ

АНТИГЕН

ГЕМОЛІТИЧНА СИСТЕМА

ОСНОВНИЙ ДОСЛІД

СХЕМИ РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

ВИЗНАЧЕННЯ ПРОЦЕНТУ ІММОБІЛІЗАЦІЇ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ

ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ

МЕЛАНЖЕРНИЙ МЕТОД Н.М.ОВЧИННИКОВА РЕАКЦІЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ

ХІД ВИЗНАЧЕННЯ

ОСНОВНИЙ ДОСЛІД

ОЦІНКА ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ

РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ - РІФ (РІФ-АБС І РІФ-200) ДЛЯ СПЕЦИФІЧНОЇ СЕРОДІАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ

ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТІВ

ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ СОРБЕНТУ

РЕЗУЛЬТАТИ ТИТРУВАННЯ СОРБЕНТУ

ТИТРУВАННЯ АНТИВИДОВОЇ ЛЮМІНЕСЦІЮЮЧОЇ СИРОВАТКИ

ПРИКЛАД ВИЗНАЧЕННЯ ПОПЕРЕНЬОГО ТИТРУ ЛЮМІНЕСЦІЮЮЧОЇ АНТИВИДОВОЇ СИРОВАТКИ

II. ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-АВС

III. ПОСТАНОВКА РІФ - АБС 3 КРОВ'Ю, ВЗЯТОЮ З ПАЛЬЦЯ

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ-200

ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-200

РЕАКЦІЯ ІМУНОФЛУОРЕСЦЕНЦІЇ (РІФ-Ц) І РІФ-10 ДЛЯ ЛІКВОРДІВАГНОСТИКИ СИФІЛІСУ

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РІФ-Ц

ТЕХНІКА ПОСТАНОВКИ РІФ-Ц

ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ (ІФА)

ІФА-ЕТАП

ПІДГОТОВКА ДО ДОСЛІДУ

I ФАЗА

II ФАЗА

III ФАЗА ПРИГОТУВАННЯ СУБСТРАТУ

ПРАВИЛА РОБОТИ У СЕРОЛОГІЧНИХ ЛАБОРАТОРІЯХ

АПАРАТИ, ПРИЛАДИ, УСТАТКУВАННЯ

РОБОТИ З ІНФІКОВАНИМ МАТЕРІАЛОМ

ЗАХОДИ НА ВИПАДОК АВАРІЇ

ПОРЯДОК ВИДАННЯ ЗАРАЖЕНИХ СИФІЛІСОМ КРОЛИКІВ АБО ЗАВИСІ БЛІДИХ ТРЕПОНЕМ