МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ
Н А К А З
27.04.2005 N 38
Зареєстровано в Міністерстві
юстиції України
30 червня 2005 р.
за N 700/10980
Про затвердження Інструкції із серологічного контролю
рівня антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби птиці
в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА)
Відповідно до статті 7 Закону України "Про ветеринарну
медицину" ( 2498-12 ), Положення про Державний департамент
ветеринарної медицини, затвердженого постановою Кабінету Міністрів
України від 8 червня 2001 року N 641 ( 641-2001-п ), та з метою
забезпечення епізоотичного благополуччя у птахогосподарствах
України Н А К А З У Ю:
1. Затвердити Інструкцію із серологічного контролю рівня
антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби птиці в реакції затримки
гемаглютинації (РЗГА) (додається).
2. Директору Державного центру ветеринарної медицини
птахівництва Демиденку В.М. подати даний наказ на державну
реєстрацію до Міністерства юстиції України та в 10-денний термін
забезпечити його тиражування і надсилання установам ветеринарної
медицини Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та
Севастополя.
3. Головним державним інспекторам ветеринарної медицини
Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя
довести цю Інструкцію до відома установ системи ветеринарної
медицини України та забезпечити контроль за її виконанням.
4. У зв'язку з прийняттям даного наказу вважати такими, що не
застосовуються на території України, "Методические указания по
серологическому контролю напряженности иммунитета при Ньюкаслской
болезни птиц с помощью реакции задержки гемагглютинации",
затверджені ГУВ МСГ СРСР N 115-6а від 18.05.79.
5. Контроль за виконанням даного наказу покласти на
заступника Голови Державного департаменту ветеринарної медицини
Вержиховського О.М.
Голова Державного
департаменту ветеринарної
медицини П.І.Вербицький
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Державного
департаменту ветеринарної
медицини
27.04.2005 N 38
Зареєстровано в Міністерстві
юстиції України
30 червня 2005 р.
за N 700/10980
ІНСТРУКЦІЯ
із серологічного контролю рівня антитіл
до вірусу ньюкаслської хвороби птиці в реакції
затримки гемаглютинації (РЗГА)
1. Загальні положення
1.1. Інструкція призначена для серологічного контролю
напруженості імунітету птиці до ньюкаслської хвороби (далі - НХ),
оцінки ефективності специфічної профілактики, визначення
оптимальних строків вакцинації (ревакцинації) птиці, а також для
контролю епізоотичної ситуації з НХ у птахогосподарствах.
1.2. Контроль напруженості імунітету проти НХ проводять
лабораторії ветеринарної медицини птахогосподарств, державної
ветеринарної медицини, спеціалізовані лабораторії ветеринарної
медицини з хвороб птиці та акредитовані лабораторії ветеринарної
медицини.
1.3. Контроль ґрунтується на виявленні специфічних антитіл
(антигемаглютинінів) у сироватці крові птиці за допомогою реакції
затримки гемаглютинації (РЗГА).
1.4. Серологічний контроль поголів'я птиці здійснюють через
кожні 15-20 днів після застосування вакцини проти НХ або виходячи
з епізоотичної ситуації в конкретному господарстві.
1.5. Дослідженню підлягають 25 проб сироваток крові від
птиці, однієї партії, в об'ємі не менше 0,5 куб.см, узятих з
різних місць пташника (залу) по діагоналі приміщення.
1.6. Результат серологічного контролю реєструють в
спеціальному журналі.
1.7. Зберігання та транспортування досліджуваних проб крові
від птиці та проб сироваток крові проводять згідно з розділом 1
"Методы отбора проб" (п.1.2, 1.3, 1.4, 1.5) ГОСТу - 25587-83
"Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики
болезни Ньюкасла".
2. Постановка реакції затримки гемаглютинації
(далі - РЗГА) (макрометодом)
2.1. Обладнання та реактиви:
антиген сухої вірус-вакцини проти НХ із штамів "Ла-Сота",
екстраембріональна алантоїсна рідина від курячих ембріонів,
інфікованих вакцинними штамами вірусу хв. Ньюкасла, з
гемаглютинувальним титром не менше 1:8;
досліджувані сироватки крові птиці;
1%-на суспензія еритроцитів півнів-донорів на
фосфатно-буферному розчині (далі - ФБР), рН 7,0, 7,2, 7,4;
контрольні (еталонні) позитивні та негативні сироватки;
пластини полістиролові титраційні з лунками, позначеними
літерою "V";
центрифуга лабораторна на 2000 об/хв;
наконечники одноразові;
піпетки градуйовані на 1,0; 2,0; 5,0 і 10,0 мл або дозатори
автоматичні на 50-200 мкл, 1000 мкл;
розчин фізіологічний 0,87%-ний з рН 7,0-7,2;
вода дистильована ГОСТ 6709-72;
колби конічні скляні на 50 куб.см, 250 куб.см, 1000 куб.см з
лабораторними пробками згідно з ГОСТ 1770-74;
штативи лабораторні бактеріологічні для пробірок;
пробірки лабораторні скляні на 5 куб.см, 10 куб.см,
15 куб.см, 20 куб.см згідно з ГОСТ 25336-82;
шафа сушильна;
ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,01 г;
кювети лабораторні ниркоподібні (зливні);
натрію хлорид ГОСТ 4233-77;
пробірки для центрифуги;
камера холодильна;
розчин для дезінфекції: 3%-ний розчин їдкого натру згідно з
ГОСТ 4328-77 або інші дезінфекційні розчини;
ємність зливна для відпрацьованого матеріалу;
5%-ний розчин лимоннокислого натрію на фізіологічному розчині
або розчин Альсивера (24,6 г глюкози, 9,6 г лимоннокислого натрію,
дистильованої води 1200 мл);
термостат на 37 град. С.
2.2. Підготовка антигену
Уміст ампули (флакона) сухої вірус-вакцини з штаму "Ла-Сота"
(активністю не менше 8,5 lg EID 50 куб.см) розчиняють
фізіологічним розчином у співвідношенні 1:5.
2.3. Приготування 1%-ної суспензії еритроцитів
півнів-донорів
Для одержання 1%-ної суспензії еритроцитів беруть кров тільки
у не вакцинованих проти НХ півнів-донорів старше 6-місячного віку,
еритроцити яких не дають спонтанної аглютинації і сироватки крові
періодично перевіряються на відсутність антитіл до НХ.
2.3.1. Кров беруть не менше ніж у трьох півнів, з
підкрильцевої вени в колбу з розчином Альсивера в рівних об'ємах
або у флаконі з 5%-ним розчином лимоннокислого натрію на
фізіологічному розчині (рН 7,0 - 7,2) у співвідношенні 1:3.
Одержану кров тричі відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або
ФБР (рН 7,0; 7,2), осаджуючи еритроцити, центрифугуючи протягом
2-5 хвилин при 800 об/хв. З осаду відмитих еритроцитів готують
1%-ну суспензію і зберігають не більше як 2 доби при t +4 град. С.
Промиті та ущільнені еритроцити зберігають у вигляді 50%-ної
суспензії на фізіологічному розчині (рН 7,2) протягом 5 діб при
температурі +4 град. С в холодильній камері у скляній колбі з
ватно-марлевою пробкою.
2.4. Одержання досліджуваних сироваток.
Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки,
попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений
згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою,
потім пробірки вносять у термостат на 20-30 хвилин при 37 град. С.
Далі проби крові витримують у холодильнику при +4 град. С до
утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті
пронумеровані пробірки і досліджують в РЗГА.
Сироватки крові інших видів птиці можуть викликати
аглютинацію еритроцитів півнів. Тому в разі виявлення такої
особливості проводять додаткову обробку сироваток еритроцитами.
Для цього 0,025 мл осаду еритроцитів додають до 0,5 мл сироватки,
струшують та залишають на 30 хвилин. Еритроцити осаджуються
центрифугуванням при 800 об/хв протягом 2-5 хвилин та оброблену
сироватку зливають.
2.5. РЗГА ставлять у два етапи:
титрування антигену в реакції гемаглютинації (РГА) для
обчислення робочої дози вірусу;
постановка основної реакції.
РЗГА супроводжується контролями:
сироватки на ізоаглютинацію (сироватка + ФБР в рівних об'ємах
+ 1%-на суспензія еритроцитів в подвійному об'ємі). Аглютинація
повинна бути відсутня;
еритроцитів на спонтанну аглютинацію (суспензія еритроцитів +
ФБР у рівних об'ємах). Аглютинація повинна бути відсутня.
2.6. Титрування антигену в РГА
2.6.1. Спочатку готують подвійні розведення антигену від 1:2
до 1:4096. Для цього в усі лунки полістиролових пластин наливають
ФБР в об'ємі 0,25 мл. Потім у першу лунку вносять 0,25 мл вірусу,
новою піпеткою три рази піпетують і переносять 0,25 мл суміші в
другу лунку і т. ін. до потрібного розведення. З останньої лунки
0,25 мл суміші видаляють у дезрозчин. У кожну лунку новою піпеткою
додають по 0,25 мл 1%-ної суспензії еритроцитів півнів.
Паралельно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну
аглютинацію, для чого в три лунки наливають по 0,25 мл ФБР і новою
піпеткою додають по 0,25 мл 1%-ної суспензії еритроцитів.
Полістиролові пластинки струшують обережними круговими рухами і
залишають при кімнатній температурі (18-20 град. С) на 30-45
хвилин для осідання еритроцитів у контролі.
2.6.2. Результати РГА виражають хрестами, в залежності від
ступеня інтенсивності реакції.
Реакція на три хрести (+ + +). По периметру лунки утворюється
осад у вигляді "парасольки" з рожевими краями.
Реакція на два хрести (+ +). Пройшла менш інтенсивна
аглютинація, при цьому аглютиновані еритроцити мають зубчатий
вигляд.
Реакція на один хрест (+) має вигляд незначної аглютинації на
дні лунки.
Негативна реакція (-) аналогічно контролю має вигляд
ґудзика, який при нахилі пластини стікає.
2.6.3. За гемаглютинувальний титр вірусу або одну
гемаглютинувальну одиницю 1 (ГАО) приймають найбільше розведення,
де чітко виражена аглютинація еритроцитів у вигляді парасольки,
але не менш як на 2 хрести.
Наприклад, чітко виражена гемаглютинація, одержана в
розведенні 1:64, тобто 0,25 мл вірусу в розведенні 1:64, містить
одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО). Для постановки РЗГА
потрібно брати 4 ГАО в 0,25 мл, що становить робочу дозу вірусу,
яка використовується при постановці основної реакції.
Для визначення робочої дози граничний титр вірусу ділять на
4, тобто в наведеному прикладі 4 ГАО в 0,25 мл будуть міститися
при розведенні вірусу 1:16 (64:4=16).
Для приготування робочого розведення вірусу, який містить
4 ГАО в 0,25 мл, потрібно взяти 1 мл вихідного вірусу і додати
15 мл ФБР. Підібрану робочу дозу вірусу необхідно використати
протягом 8 годин.
2.6.4. Перед постановкою РЗГА необхідно перевірити
правильність вибраної робочої дози вірусу (4 ГАО). Для цього в
4 лунки одного ряду і 3 лунки контрольного ряду наливають по
0,25 мл ФБР. У першу лунку з 4 наливають 0,25 мл робочої дози
вірусу. Новою піпеткою суміш тричі піпетують, а потім переносять
по 0,25 мл в наступну лунку і т. ін. Із останньої лунки 0,25 мл
суміші видаляють у дезрозчин. Після цього у лунки з антигеном та
лунки контрольного ряду додають 0,25 мл 1%-ного розчину
еритроцитів півнів, струшують круговими рухами і залишають при
кімнатній температурі (18-20 град. С) на 30-45 хвилин.
Облік реакції проводять після осідання еритроцитів у
контролі. При правильному виборі робочої дози вірусу (4 ГАО) у
першій та другій лунках повинна бути повна аглютинація
("парасолька"), а в третій може бути часткова (+); у четвертій -
аглютинація відсутня ("ґудзик") - негативний результат.
При одержанні інших показників з основного розведення вірусу
готують нове робоче розведення (більше або менше).
Більше розведення готують за наявності аглютинації в 4-й
лунці, менше - за відсутності аглютинації в 2-й лунці, тобто
збільшують або зменшують концентрацію вірусу. Якщо аглютинація
проявляється лише в 4-й лунці, то 1 мл вірусу розчиняють в 24 мл
ФБР, додаючи до вихідного розрахункового об'єму (1:16) ще
половину, а якщо аглютинація відсутня в 2-й лунці, то 1 мл вірусу
розчиняють в 8 мл ФБР, тобто беруть половину первинного
розрахункового об'єму. Після приготування нового робочого
розведення знову ставлять контроль до отримання необхідного
результату в реакції аглютинації.
2.7. Постановка РЗГА
2.7.1. Для постановки реакції в 12 лунок титраційної пластини
піпеткою вносять по 0,25 мл ФБР. Потім у першу лунку новою
піпеткою вносять 0,25 мл досліджуваної сироватки, тричі піпетують
і 0,25 мл суміші переносять у наступну лунку і т. д. до одержання
граничного розведення. З останньої лунки 0,25 мл суміші видаляють
піпеткою в ємність з дезрозчином. Після цього в усі лунки новою
піпеткою вносять по 0,25 мл робочого розведення вірусу (4 ГАО).
Пластини струшують круговими рухами та після 30-45-хвилинної
взаємодії сироватки з вірусом у кожну лунку додають по 0,5 мл
1%-ної суспензії еритроцитів.
Реакцію ставлять при кімнатній температурі (18-20 град. С) і
ведуть облік результатів протягом 25-45 хвилин.
За наявності в сироватці антитіл настає затримка
гемаглютинації, при цьому еритроцити випадають в осад у вигляді
ґудзиків з рівними краями.
2.7.2. Титром сироватки вважають найбільше її розведення, яке
дає чітку затримку гемаглютинації (наявність "ґудзика") робочої
дози антигену НХ.
2.7.3. Достовірність результату необхідно оцінювати в
порівнянні з негативним контролем, який не повинен давати титр
2
>1/4 (>2 або >log 2), і позитивною контрольною сироваткою, титр
2
якої повинен відповідати її відомому титру. Тому паралельно з
досліджуваними сироватками ставляться контрольні реакції з
позитивною та негативною еталонною сироваткою.
При правильному приготуванні і розведенні антигену еталонна
сироватка має пригнічувати його гемаглютинацію до зазначеного на
етикетці титру.
3. Методика постановки РЗГА мікрометодом
3.1. Реактиви:
антиген сухої вірус-вакцини проти НХ із штамів "Ла-Сота";
досліджувані сироватки крові птиць;
1%-на суспензія еритроцитів півня на ФБР (рН 7,0; 7,2).
3.1.1. Обладнання:
піпетки градуйовані;
дозатори автоматичні на 5-50 мкл і одноразові наконечники до
них;
мікротитратори одно або восьмиканальні будь-якої моделі з
варіювальним або стабільним об'ємом у межах 0,025-0,05 куб. см;
полістиролові мікропанелі для імунологічних реакцій
(V-варіант).
3.2. Підготовка антигену
Вакцину в ампулах (флаконах) ресуспензують до вихідного
об'єму вірусу.
3.3. Приготування еритроцитів півня-донора.
Для отримання еритроцитів використовують півнів-донорів, які
не вакциновані проти НХ і періодично перевіряються на відсутність
антитіл. Кров беруть з підкрильцевої вени як мінімум від 3
півнів-донорів, змішують у рівному об'ємі у розчині Альсивера або
у флаконі з 5%-ним розчином лимоннокислого натрію на
фізіологічному розчині (рН 7,0;7,2) у співвідношенні 1:3, тричі
відмивають фізіологічним розчином (0,1 М) або ФБР (рН 7,0; 7,2) і
центрифугують при 800 об/хв протягом 2-5 хвилин. З осаду
еритроцитів готують 1%-ну суспензію. Зберігати суспензію можна в
умовах холодильника при температурі 4 град. С до появи ознак
гемолізу еритроцитів. Крім нативних, у роботі можуть бути
використані стабілізовані (формалінізовані) еритроцити півня.
3.4. Одержання сироватки крові
Підготовку сироваток крові здійснюють відповідно до пункту
2.4.
3.5. РЗГА проводять поетапно, спочатку визначають
гемаглютинувальний титр вірусу в РГА, для обчислення робочої дози
вірусу, а потім становлять основну реакцію - визначення титру
антитіл у досліджуваних сироватках крові.
3.6. Реакція гемаглютинації
3.6.1. 0,025 мл ФБР уносять у кожну лунку V-подібної
полістиролової пластини.
3.6.2. У першу лунку вносять 0,025 мл суспензії вірусу. Для
точного визначення рівня гемаглютиніну це необхідно робити з
точного первинного розведення, наприклад 1/3, 1/5, 1/7 тощо.
3.6.3. Зробити подвійне розведення вірусу по 0,025 мл через
усю пластину.
3.6.4. Додати по 0,025 мл ФБР у кожну лунку.
3.6.5. Додати по 0,025 мл 1% суспензії еритроцитів півнів у
кожну лунку.
3.6.6. Злегка струсити пластину круговими рухами. Залишити
для осідання еритроцитів протягом 40 хв. при кімнатній температурі
(близько +20 град. С) або на 60 хвилин при температурі +4 град. С
(якщо зовнішня температура дуже висока) до тих пір, поки в
контролі еритроцити осядуть у вигляді ґудзика.
3.6.7. Наявність гемаглютинації (далі - ГА) визначається при
нахилі пластини і виявленні стікання еритроцитів. Визначення титру
гемаглютинації проводять за найбільшим розведенням, у якому
виявлена ГА (немає стікання). Це розведення означає 1
гемаглютинувальну одиницю (ГАО) і має бути чітко вирахуваною з
первинного розведення вірусу.
3.7. Реакція затримки гемаглютинації
3.7.1. 0,025 мл ФБР уносять у кожну лунку V-подібної
пластини.
3.7.2. 0,025 мл сироватки вносять в першу лунку кожного ряду
пластини.
3.7.3. Зробити подвійне розведення сироватки по 0,025 мл
через усю пластину.
3.7.4. У кожну лунку вносять 0,025 мл антигену, що містить
4 ГАО вірусу, та залишають пластину на 30 хвилин при температурі
20 град. С або на 60 хвилин при 4 град. С.
3.7.5. 0,025 мл 1%-ної суспензії еритроцитів півня додати в
кожну лунку, злегка струсити і дати осісти еритроцитам протягом 40
хвилин при кімнатній температурі (близько 20 град. С), якщо
навколишня температура дуже висока, - 60 хв при температурі
4 град. С. Еритроцити випадають в осад у вигляді ґудзика.
3.7.6. Титр затримки ГА визначається за найбільшим
розведенням сироватки, яке дає повну затримку ГА 4 ГАО вірусу.
Наявність ГА визначається при нахилі пластини. Тільки в тих
лунках, у яких стікання еритроцитів таке саме, як у контрольних
лунках, у які залиті тільки 0,025 мл еритроцитів і 0,05 мл ФБР,
ураховується затримка гемаглютинації.
3.7.7. Достовірність результату необхідно оцінювати в
порівнянні з негативним контролем, який не повинен давати титр
2
>1/4 (> 2 або >log 2), і позитивною контрольною сироваткою, титр
2
якої повинен відповідати її відомому титру.
4. Облік одержаних результатів
Рівень гуморального імунітету залежить від штаму використаних
вакцин, методів їх застосування, строків вакцинації і ревакцинації
та епізоотичної ситуації.
4.1. За результатами РЗГА визначають ефективність імунізації
в партіях щепленої птиці у відсотках.
За вимогами серологічного контролю груповий імунітет
уважається сформованим, а птиця - не сприйнятлива до НХ при
наявності у 80% і більше досліджуваних сироваток після щеплень
живими вакцинами та у 90% - після щеплень інактивованими вакцинами
таких титрів антитіл:
у курчат до місячного віку - 1:8 і вище;
у курчат від 30 до 60-денного віку - 1:8 - 1:16 (домінуючі) і
вище;
у молодняку від 60 до 140 днів - 1:16 - 1:32 (домінуючі) і
вище;
у дорослої птиці - 1:32 - 1:64 (домінуючі) і вище.
При ефективності імунізації менше 80% після щеплень живими
вакцинами та менше 90% після застосування інактивованих вакцин
птиця підлягає ревакцинації.
4.2. Граничними поствакцинальними титрами для курчат до
двохмісячного віку є титри у співвідношенні 1:512, а для птиці
старших груп - 1:1024.
4.3. Виявлення у щепленої птиці титрів антитіл 1:4096 і вище
через 6 місяців після вакцинації свідчить про можливу циркуляцію в
стаді польового вірусу НХ. Така група птиці ставиться на
ветеринарний контроль до одержання (через 2 тижні) результатів
повторного дослідження проб парних сироваток крові в одних і тих
самих птахів.
4.4. Зниження або стабілізація рівня антитіл та зменшення
кількості птахів з високим рівнем антитіл при повторних
дослідженнях проб сироваток крові є наслідком поствакцинальної
реакції та свідчить про відсутність циркуляції в стаді польового
вірусу НХ.
4.5. Приріст та збільшення кількості сироваток крові з
високим рівнем антитіл - 1:2048 - 1:4096 і вище через 21 день
після вакцинації, без видимих клінічних ознак і
патолого-анатомічних змін у трупах птахів є підставою для
проведення ретельного вивчення епізоотичної ситуації, клінічної та
патолого-анатомічної картин серед птиці птахогосподарства, а також
проведення систематичних серологічних та вірусологічних
досліджень, виділення та ідентифікації вірусу.
4.6. При постановці діагнозу враховують лабораторні
дослідження: виділення вірусу на курячих ембріонах, його індикація
та ідентифікація в РГА-РЗГА, визначення вірулентності вірусу на
курячих ембріонах та курчатах. Для підтвердження діагнозу
використовують інші реакції: нейтралізації, крово-крапельну
реакцію гемаглютинації, імуноферментний аналіз, полімеразну
ланцюгову реакцію.
4.7. У зв'язку з масовим застосуванням у великих
птахогосподарствах інактивованих вакцин проти НХ світових
фірм-виробників з Франції, Нідерландів, Німеччини та інших у РЗГА
реєструються високі титри антигемаглютинінів - 1:4096 і вище до
декілька десятків логарифмів. У таких випадках у зазначених
птахогосподарствах посилюють ветеринарний контроль та обов'язково
проводять дослідження парних сироваток крові від підконтрольної
птиці.
4.8. Коли після вакцинації, протягом певного часу при
повторному дослідженні парних сироваток з'являється строкатість
показників (розбіжність більше 10 log), і титри залишаються
незмінно високими, але не реєструються характерні клінічні ознаки
та патолого-анатомічні зміни, такий стан є підставою для
проведення поглибленого епізоотичного обстеження, систематичних
серологічних та вірусологічних досліджень. Такі позамежові
показники можуть виникати при внесенні у вакцину імуномодуляторів
- препаратів селезінки великої рогатої худоби. Надалі при серійних
дослідженнях (через 14 днів) парних сироваток у благополучних
господарствах титри будуть суттєво знижуватися.
Заступник голови
Державного департаменту
ветеринарної медицини О.М.Вержиховський